《Critical Reviews in Biotechnology》：Current status of genetic engineering for sophorolipids production
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槐糖脂（sophorolipids, SL）是一类微生物生物表面活性剂，由亲水槐糖头和疏水脂肪酸尾组成。槐糖脂因其在传统及新型应用中作为石油基表面活性剂更可持续且功能替代品的潜力，在学术界和商业生化工业中均受到重视。然而，槐糖脂的市场竞争力和经济可行性目前面临
槐糖脂（sophorolipids, SL）是一类微生物生物表面活性剂，由亲水槐糖头和疏水脂肪酸尾组成。槐糖脂因其在传统及新型应用中作为石油基表面活性剂更可持续且功能替代品的潜力，在学术界和商业生化工业中均受到重视。然而，槐糖脂的市场竞争力和经济可行性目前面临生产性能水平、生产成本以及槐糖脂形态选择性及其相关功能性能方面的重大挑战。对生产菌株（如主生产菌株Starmerella bombicola及其他菌株）进行遗传工程（genetic engineering），可能成为改善槐糖脂生产多方面性能的有力工具，包括槐糖脂的滴度（titers）、得率（yields）、生产率（productivities）、新型形态、产物选择性、新型或可持续发酵原料利用的改善、工艺可放大性以及过程强化。本综述旨在聚焦槐糖脂生产遗传工程的研究现状，包括对重组槐糖脂生产菌构建相关代表性研究的评估、其具体目标与成就，以及与之相关的挑战和有待填补的知识空白。此外，本综述还进一步讨论了应如何改进槐糖脂生产菌的遗传工程工具箱及生理学认知。所提供的观点、讨论和建议应有助于未来的研发工作，以进一步改进槐糖脂生产菌的遗传工程、槐糖脂生物工艺开发及其进一步商业化。
意义声明：本综述是为数不多聚焦槐糖脂生产遗传工程的深度评估之一。遗传工程有望成为改善槐糖脂生产多方面性能的有力工具，包括槐糖脂的滴度、得率、生产率、新型形态、产物选择性、新型或可持续发酵原料利用的改善、工艺可放大性以及过程强化。这对于使这一领先的生物表面活性剂在与传统石油基表面活性剂的竞争中具备市场竞争力甚至引领市场至关重要。研究团队在槐糖脂生产、遗传工程和工业生物技术方面兼具学术与工业经验的见解，可为未来槐糖脂及工业生物技术研究提供重要参考。
引言
槐糖脂（sophorolipids, SL）是一类备受学术界和工业界关注的生物表面活性剂，属于糖脂（glycolipid）家族，由亲水槐糖头与疏水脂肪酸尾组成。其替代石油基表面活性剂的潜力源于非致病性微生物生产、高生产滴度与得率、优良表面活性等优势，应用领域涵盖清洁、个人护理、采油、食品、农业、生物修复及医药等。尽管研发和商业化进程加快，但受高生产成本限制，SL市场份额仍有限。遗传工程（genetic engineering）是提升SL生产性能的核心工具。本综述聚焦SL生产遗传工程的研究现状，补充现有综述的不足，系统评估重组生产菌构建的策略与成果。
槐糖脂合成途径与生产
Starmerella bombicola是研究最深入的SL生产菌，其野生型ATCC 22214被广泛使用。其他已报道的生产菌包括Candida batistae、Candida apicola等。SL合成可分为疏水尾部形成、槐糖头组装和结构修饰三个阶段。
Starmerella bombicola中的槐糖脂合成
疏水尾部的形成：SL疏水尾通常为C16-C18不饱和脂肪酸，可通过疏水底物分解代谢、直接掺入或葡萄糖从头合成获得。脂肪酸转运相关研究有限，仅表征了ALSE转运蛋白。过量的游离脂肪酸（free fatty acids, FFA）可通过β-氧化（β-oxidation）或SL合成途径代谢。CYP52M1单加氧酶在ω或ω-1位羟基化C16-C18脂肪酸，是SL合成的关键步骤。
亲水槐糖头的组装：槐糖头由两个葡萄糖单元经β-1,2糖苷键连接。糖基供体为尿苷二磷酸（uridine diphosphate, UDP）激活的葡萄糖，经UGTA1和UGTB1两次糖基转移逐步添加。UGTA1敲除后仍能产生SL，提示存在未知糖基转移酶或功能冗余。
槐糖脂的修饰与转运：多数SL随后发生乙酰化和内酯化修饰。乙酰转移酶（acetyltransferase, AT）催化乙酰基添加。SL的胞外转运由SbSLMdr1和SbSLMdr2介导。分泌型槐糖脂内酯酶（Sble）在胞外催化内酯化。近期研究发现bolaform中间体可能是内酯化SL的前体，且SL合成途径中仍有未鉴定的酶。
其他生物中的槐糖脂合成
Candida apicola：首个被发现产生SL的酵母，但相关合成通路研究有限，已分离两种细胞色素P450单加氧酶（Cyp52e1和Cyp52e2），但功能尚未深入表征。
Candida batistae：通过系统发育分析于2008年被鉴定为SL生产菌，其合成途径尚未阐明。其产物以ω-羟基酸性SL为主，与S. bombicola的ω-1内酯型SL不同，提示其P450单加氧酶特性及Sble活性存在差异。
其他物种：Wickerhamiella domercqiae可从含油废水中分离，其产物形态受氮源调控。Metschnikowia churdharensis无需外加疏水底物即可合成酸性和内酯型SL。
Starmerella bombicola的遗传工程
针对产物选择性的Starmerella bombicola工程改造
敲除β-氧化途径中的MFE-2基因可使SL产品链长均一，并在以十二醇为底物时使产量提高188%。敲除乙酰转移酶基因（Δat）可产生100%非乙酰化SL，但总产量显著下降。过表达Sble（oe sble）可生产99%内酯型SL，产量达139 g/L；敲除Sble（Δsble）则产生100%酸性SL，产量124 g/L。研究还提出了bolaform SL作为内酯化前体的新观点，对SL选择性改造具有潜在影响。
提高槐糖脂产量的Starmerella bombicola工程改造
敲除过氧化物酶体转运蛋白基因PXA1可使SL产量提高50.5%；在此基础上过表达CYP52M1进一步提高至88.50 g/L，5 L补料分批发酵中滴度达232.27 g/L，生产率为1.46 g/L/h。删除Rlp及转录因子Leu3和Ztf1的三重突变株产量达97.44 g/L，比野生型提高50.2%，得率0.70 g/g。敲除负调控因子Sapl1-4可提高产量90%，生产率翻倍。删除Faa1（脂肪酰辅酶A合成酶）可使产量提高50.2%。应用CRISPR-Cas9过表达CYP52M1和CPR并敲除SBLE和PXA1，酸性SL产量达99.5 g/L，为野生型的5.5倍。异源表达透明颤菌血红蛋白（VHb）可改善缺氧条件下的产量。
面向底物利用的Starmerella bombicola工程改造
用Ustilago maydis的CYP1替换Cyp52M1可产生C16:0尾的SL，但效率低，需共表达异源细胞色素P450还原酶。引入铜绿假单胞菌的鼠李糖基转移酶基因（rhlA、rhlB）可产生含鼠李糖的新型SL。异源表达草酸青霉纤维素酶基因使S. bombicola能利用木质纤维素底物，与野生型共培养可实现SL生产。
其他槐糖脂生产菌的遗传工程
念珠菌属物种
C. apicola的P450在E. coli中表达进行了初步表征。C. apicola中鉴定出与果聚糖水解相关的基因，可用于改造以利用果糖类底物。C. albicans中敲除木糖还原酶（GRE3）和木糖醇脱氢酶（XYL2）影响木糖利用。通过表达白细胞介素-17A可降低C. albicans致病性，对非致病化改造具有意义。
念珠菌属之外
Rhodotorula mucilaginosa中异源过表达苹果酸酶可提高脂质产量，并鉴定了脂质合成相关基因（Acc1、Dga1、Fas1/Fas2）。Wickerhamomyces anomalus的转录组分析鉴定了废油及辛酸胁迫下差异表达基因，有助于脂肪酸底物利用研究。Pseudohyphozyma bogoriensis基因组中鉴定出推定纤维素酶基因，可能用于木质纤维素利用。
合成生物学工具箱与生理学考量
合成生物学工具箱
转化技术：S. bombicola对抗生素具有广泛抗性，目前仅报道潮霉素和诺尔丝菌素两种选择标记。现有标记回收策略耗时费力，Cre-LoxP系统可能提高效率。
CRISPR工具：CRISPR-Cas9已成功应用于S. bombicola，双基因敲除效率达100%，三基因敲除效率13.3%。CRISPR-Cas12也被用于代谢工程改造。
质粒：目前尚无S. bombicola稳定附加体质粒的报道，但来自乳酸克鲁维酵母的panARS序列可能为实现稳定质粒转化提供途径。
解析Starmerella bombicola生理学的复杂性
适应性实验室进化：尚未有S. bombicola的ALE研究报道，但已有ARTP诱变育种结合高通量筛选获得高产突变株的实例。
组学研究：代谢组学揭示了bolaform SL形成与8-羟基鸟苷的关联；代谢通量分析将ΔMFE-2菌株产量下降归因于胞内脂酰辅酶A和柠檬酸水平变化。蛋白质组学鉴定Dap1可能为SL生产正向调控因子。转录组学揭示端粒定位效应在指数期抑制SL途径。首个基因组规模代谢模型已建立。
诱变育种：传统随机诱变和紫外诱变仍具有价值，可结合合成诱导系统、表位标签技术、快速基因拼接等工具进行菌株优化。
结论
遗传工程已证明是提升槐糖脂生产性能、产物多样性、选择性及底物利用能力的强有力工具，尤其是在S. bombicola中取得了显著成果。然而，对生产菌生理学认知不足、合成生物学工具箱仍不完善、其他生产菌研究欠缺等知识缺口依然存在。未来研究应深入解析SL生产相关代谢网络，利用组学手段和合成生物学工具，拓展非模式生产菌的遗传操作体系，并加强菌株鲁棒性改造，以推动SL工业化的经济可行性。
