整合培养依赖法、MALDI-TOF MS鉴定与长读长宏条形码解析自然发酵Bella di Cerignola PDO食用橄榄的微生物群落

《Foods》：Unveiling the Microbial Community of Naturally Fermented Bella di Cerignola PDO Table Olives Integrating Culture-Dependent, MALDI-TOF MS Identification and Long-Read Metabarcoding Approaches

　　

食用橄榄的自然发酵由影响产品质量和安全性的复杂微生物群落驱动。本研究采用培养依赖与培养非依赖相结合的方法，调查了Bella di Cerignola食用橄榄在盐水中自然发酵中期和后期（3至6个月）的微生物群落。研究人员通过活菌计数、MALDI-TOF MS分离鉴定以及靶向16S rRNA基因和ITS区的长读长宏条形码技术对细菌和真菌群落进行了监测。乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）在整个发酵过程中始终保持优势地位，而酵母菌群在最后阶段逐渐下降。MALDI-TOF MS鉴定出Lactiplantibacillus pentosus为主要的可培养细菌物种，Pichia membranifaciens、Pichia manshurica和Wickerhamomyces anomalus为优势酵母菌。宏条形码分析证实了这些酵母菌的生态相关性，并揭示了以未被培养方法回收的Secundilactobacillus collinoides/paracollinoides群和Lactiplantibacillus plantarum群为主的细菌群落。MALDI-TOF MS与长读长宏条形码分析的整合提供了Bella di Cerignola橄榄微生物群落的全面概览，证明了这两种方法在自然橄榄发酵微生物群特征描述以及鉴定可用作发酵剂培养物进一步研究的本土候选菌株方面的互补价值。

**研究背景与存在问题**

食用橄榄是地中海国家消费最广泛的发酵蔬菜产品之一，兼具经济价值和营养价值。传统生产中，食用橄榄发酵在无发酵剂添加条件下自然进行，依赖果实表面和加工环境中天然存在的本土微生物群落，多种内在和外在因素（品种、果实成熟度、盐浓度、温度、pH和水活度）强烈影响微生物种群动态。Bella di Cerignola是意大利重要食用橄榄品种，广泛种植于普利亚大区并获得La Bella della Daunia受保护原产地命名（Protected Designation of Origin, PDO）地位，以体型硕大、果肉紧实和感官品质高而闻名，通常经盐水自然发酵以保留独特感官属性。该发酵体系主要由乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）和酵母菌组成，LAB主导盐水酸化，确保微生物安全性和货架期；酵母菌则参与香气形成和橄榄苦苷（oleuropein）降解。传统橄榄微生物群研究依赖培养依赖技术，但这类方法只能捕获发酵食品中微生物多样性的一小部分。MALDI-TOF MS虽显著提高了分离株鉴定效率，但培养非依赖方法对全面解析微生物群落、尤其是不可培养类群至关重要。以往针对Bella di Cerignola自然发酵过程中微生物群落时间演替的研究十分有限，短读长宏条形码的分类分辨率也往往难以区分密切相关的物种。为此，研究人员假设培养依赖分析与长读长宏条形码的整合可揭示比单一方法更广泛的微生物多样性，从而更全面描述发酵过程中的微生物群落。

**研究内容与技术方法**

样品源自意大利普利亚大区Consorzio "La Bella della Daunia D.O.P"提供的同一工业批次同一发酵容器的Bella di Cerignola PDO食用橄榄，在自发发酵第3（M3）、第4（M4）和第6（M6）个月采样，每时间点设三个生物学重复。主要技术方法：（1）选择性培养基（DRBC、MRS、M17）活菌计数；（2）MALDI-TOF MS鉴定87株分离物；（3）Oxford Nanopore平台长读长宏条形码测序（16S rRNA和ITS）；（4）Emu、Kraken2、dnabarcoder物种分类；（5）α/β多样性（Shannon、Simpson指数、Bray-Curtis、PERMANOVA）及重复测量ANOVA和Tukey's HSD统计学分析（p ≤ 0.05）。

**研究结果**

**3.1 自然发酵过程中可培养微生物群落的演替**

活菌计数显示，M3时LAB已成为优势菌群，MRS和M17上密度分别为6.82和6.74 log₁₀ CFU/mL，酵母菌为5.05 log₁₀ CFU/mL。M4时各菌群相对稳定，M6时LAB维持高密度而酵母菌降至3.89 log₁₀ CFU/mL，较M3下降超过1个对数单位。重复测量ANOVA表明发酵时间对DRBC（p = 0.002）和M17（p = 0.003）计数有显著影响，Holm校正后仍显著，M6显著低于M3和M4。pH在整个监测期内仅从4.064轻微降至3.976。

**3.2 MALDI-TOF MS鉴定的可培养微生物**

共87株分离物经MALDI-TOF MS鉴定。Lactiplantibacillus pentosus在M3时占MRS全部菌落，为绝对优势细菌物种；Pediococcus parvulus和Pediococcus ethanolidurans亦被检出。酵母菌以Pichia membranifaciens、Pichia manshurica和Wickerhamomyces anomalus为主。M4时L. pentosus仍占优势，仅一株Lactiplantibacillus plantarum被鉴定。M6时L. pentosus持续占优，酵母菌组成保持稳定。

**3.3 长读长宏条形码揭示的细菌群落**

16S宏条形码共产生9.34百万条reads，其中8.81百万条（94.4%）通过质量过滤。细菌α多样性自M3至M6逐渐下降（Shannon指数2.60降至1.85，p < 0.001），β多样性分析显示不同时间点群落组成存在显著差异（PERMANOVA, R² = 0.95, p = 0.028）。属水平上以Secundilactobacillus、Lactiplantibacillus和Pediococcus为主。种水平上，Secundilactobacillus collinoides/paracollinoides群在M4和M6成为优势类群，相对丰度自M3的13%增至M6的41%；L. plantarum群在M3最丰富；Pediococcus damnosus由15%降至3%。值得注意的是，S. collinoides/paracollinoides群未被培养依赖方法分离获得。

**3.4 长读长宏条形码揭示的真菌群落**

ITS宏条形码显示真菌α多样性（Shannon和Simpson指数）在M4和M6高于M3（p < 0.01），但物种丰富度无显著变化（p = 0.69）。β多样性分析显示不同时间点间存在较小但显著的差异（平均Bray-Curtis相异度0.09–0.16）。属水平上Pichia和Wickerhamomyces全程占主导，其他属相对丰度均低于2%；种水平上P. membranifaciens、P. manshurica和W. anomalus为全程优势物种，与培养依赖法鉴定结果高度一致。

**讨论与结论**

讨论指出，M3时高LAB计数提示发酵生态系统已成熟建立，LAB种群稳定性反映其对盐水选择条件的适应；M6酵母菌下降可能与营养耗竭、盐胁迫、代谢物积累和低pH等限制因素相关，但本研究仅直接监测pH，故这些因素应视为假设性贡献。MALDI-TOF MS揭示的L. pentosus持续优势与其碳水化合物利用、渗透压耐受和酚类化合物抗性等基因组特征相符。S. collinoides/paracollinoides群未被培养回收可能归因于其苛刻的生长需求和可变培养性，此前已有研究报道该物种在MRS等常规培养基上难以生长，其生态重要性主要通过培养非依赖方法揭示，提示该物种可能是橄榄微生物组中被忽视但具有生态意义的成员。L. plantarum群成员在16S rRNA基因水平高度相似，需额外遗传标记（如recA、pheS）或全基因组分析进行种级区分，而MALDI-TOF MS可有效互补解决该问题。真菌群落方面，三种优势酵母菌构成核心菌群，具有高盐、低pH适应性和理想技术特性，包括产生挥发性风味物质、转化酚类底物及与LAB发生积极的种间相互作用。

研究结论表明，PDO Bella di Cerignola橄榄自然发酵以稳定且高度适应的微生物生态系统为特征，LAB在整个监测期为优势菌群，酵母菌在最后阶段逐渐下降。S. collinoides/paracollinoides和L. plantarum群为主要细菌类群，P. membranifaciens、P. manshurica和W. anomalus构成核心真菌微生物群。MALDI-TOF MS与长读长宏条形码的整合提供了互补见解：前者鉴定L. pentosus为优势可培养LAB，后者揭示了未被培养方法回收的S. collinoides/paracollinoides群。该研究拓展了对PDO Bella di Cerignola橄榄微生物生态学的认知，证明了整合两类方法对识别可培养及以往被忽视微生物种群的有效性。未来研究应聚焦本土分离株的表型、技术和安全特性表征及其发酵剂适用性评价，并将采样拓展至鲜果和早期发酵阶段，结合宏基因组学、代谢组学和挥发性物质分析以进一步阐明优势微生物类群的功能角色。