基于Box–Behnken响应面法优化Gryllus bimaculatus的Neutrase酶解与Leuconostoc mesenteroides MKJW发酵工艺

《Foods》：Optimization of Enzymatic Hydrolysis and Leuconostoc mesenteroides MKJW Fermentation of Gryllus bimaculatus Using Response Surface Methodology

　　

Gryllus bimaculatus（GB）是一种有前景的可持续蛋白来源，其生物加工性能受加工条件强烈影响。酶解和乳酸菌发酵是修饰GB组分及开发增值产品的互补途径。在本研究中，研究人员采用响应面法（RSM）结合Box–Behnken设计优化两种GB生物工艺：Neutrase介导的酶解和Leuconostoc mesenteroides MKJW发酵。对于酶解，以水解度（DH）为响应，评价GB浓度、Neutrase浓度和水解时间。在测试范围内，与高预测DH相关的模型衍生条件为20%（w/v）GB、136.2 U/mL Neutrase和31 h，在此条件下实验DH为78.59%，预测值为87.03%。对于发酵，以活菌计数和体外α-葡萄糖苷酶抑制（AGI）为响应，同时评价GB浓度、蔗糖浓度和发酵时间。多响应优化确定7.1%（w/v）GB、6.7%（w/v）蔗糖和27 h为测试范围内与活菌计数和AGI同时较高相关的模型衍生条件，实验值分别为9.94 log CFU/mL和92.94% AGI，预测值分别为9.98 log CFU/mL和86.57%。总体而言，RSM能够定量识别GB水解和发酵的不同过程驱动因素，并实验评估模型衍生操作条件，为后续组成、机制和功能表征提供过程层面基础。

全球动物蛋白需求持续增加，而土地可用性、环境影响、动物福利与资源约束促使寻找替代蛋白来源。食用昆虫因潜在可持续食品和饲料配料而受到关注。其一般含高蛋白及矿物质、维生素和营养相关脂肪酸，许多食用昆虫蛋白提供必需氨基酸，比例与人类营养需求相容；昆虫生产在饲料转化和资源利用上也可优于传统畜牧系统。Gryllus bimaculatus（GB）是一种可食用蟋蟀，已用作食品和饲料配料，其营养价值已有记录。GB含大量蛋白、平衡氨基酸谱，并提供不饱和脂肪酸和矿物质，因此适合作为生物加工策略的底物，以修饰蛋白组分并开发增值配料。

蛋白水解切割肽键，生成不同分子大小的肽和游离氨基酸。酶解广泛用于修饰食品蛋白，可根据底物、酶和加工条件产生具生物活性的肽组分。水解度（DH，反映蛋白水解程度的加工指标）可反映水解程度，但DH本身不能确定水解物组成或生物活性。既往研究报道食用昆虫蛋白水解物具有抗氧化和抗炎活性。水解结果受酶特异性、底物浓度、反应时间、温度及相关过程变量强烈影响，因此优化这些变量对确定所需蛋白水解程度的加工条件很重要。乳酸发酵是传统食品加工和保藏策略，微生物将可发酵碳水化合物转化为乳酸和其他代谢物。取决于底物和微生物菌株，发酵可影响产品稳定性、感官特性和生化组成；微生物蛋白酶和肽酶也可能在发酵期间促进食品蛋白分解为低分子量肽和游离氨基酸。此外，发酵性能依赖多种相互作用因素，包括底物组成、可用碳水化合物、微生物菌株和发酵时间，因此同时优化这些变量对过程开发很重要。响应面法（RSM，一种多变量统计方法）常用于食品过程优化，可建模多个自变量对一个或多个响应的影响，识别交互、估计二次效应并确定所需响应的加工条件。Box–Behnken设计（BBD）可高效估计二阶模型，同时避免所有因素同时处于极端水平的实验组合，适合生物过程优化。既往研究表明发酵或酶加工可改变食用昆虫包括GB的营养和功能特性。然而，相互作用加工变量对Neutrase介导GB水解的影响，以及GB发酵期间微生物生长与α-葡萄糖苷酶抑制（AGI）之间的关系尚未充分表征。因此，研究人员定量评价相互作用过程变量，并实验评估两种不同GB生物工艺的模型衍生条件。酶解以GB浓度、Neutrase浓度和水解时间为变量，DH为响应；发酵采用Leuconostoc mesenteroides MKJW，一种泡菜来源菌株，先前报道具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，以GB浓度、蔗糖浓度和发酵时间为变量，活菌计数和AGI为响应。同时评价活菌计数和AGI，以确定有利于微生物生长的条件是否也与功能筛选响应相关。随后实验评价测试范围内与高预测响应相关的模型衍生条件。研究提供过程特异定量证据，揭示加工变量与微生物生长或AGI之间的不同关联模式，为后续组成、机制和功能表征提供过程层面基础。

关键技术方法概括：采用基于BBD的RSM，三因素三水平，共17个实验运行，含5个中心点重复。成年GB购自韩国华城（Hwaseong，Republic of Korea）食用昆虫农场（Cricket Farm Co.），经热风干燥、粉碎、18-mesh筛分、55 °C干燥后?18 °C储存。酶解优化以GB浓度、Neutrase浓度、水解时间为自变量，DH为响应；发酵优化以GB浓度、蔗糖浓度、发酵时间为自变量，活菌计数和体外AGI为响应。拟合二阶多项式模型，进行方差分析（ANOVA），以R²和调整R²评估拟合，多响应优化同时最大化活菌计数和AGI；模型衍生条件用双尾单样本t检验与预测值比较，每个条件4个重复，p<0.05为显著。

研究结果：

3.1. 酶解优化

3.1.1. 酶解模型拟合与统计分析
通过BBD 17 runs，以DH为响应。拟合二次响应面模型显著（F=9.32，p=0.004），解释92.3%变异（R²=0.923，调整R²=0.824），但失拟显著（p=0.007），表明二次模型未完全解释测试范围内响应变异；模型主要用于评价因素效应和识别测试范围内高DH条件，而非高精度预测。最终模型方程为：DH (%) = 81.80 + 20.43X₁ ? 0.48X₂ ? 1.61X₃ ? 6.24X₁X₂ ? 2.36X₁X₃ ? 12.36X₂X₃ ? 9.45X₁² ? 7.88X₂² ? 7.63X₃²。GB浓度（X₁）对DH正效应最强（p<0.001）；GB浓度二次项（X₁²）及Neutrase浓度与水解时间交互（X₂X₃）显著（p<0.05）。Neutrase浓度（X₂）和水解时间（X₃）线性效应不显著。最高预测DH出现在测试GB浓度上限20%（w/v），但高于此值因无法均匀混合而未纳入；20%（w/v）为实际可行范围内最高预测DH条件。

3.1.2. 响应面分析
通过三维响应面图显示，DH随GB浓度明显增加，低浓度处斜率陡；固定GB浓度时增加Neutrase浓度仅引起DH适度变化，表明DH主要受GB浓度而非酶加载驱动。GB浓度与水解时间图中，DH沿GB浓度轴梯度更陡，沿时间轴较温和；DH随时间增至一定点后接近平台。Neutrase浓度与时间交互图中，两者低水平时DH较低，同时增加至中高响应区，再增加则预测DH下降，呈非线性而非简单剂量依赖，与X₂X₃显著一致。总体GB浓度是主要因素，Neutrase浓度和时间在有限范围内增强DH后递减。

3.1.3. 酶解模型衍生条件的实验评估
模型衍生高预测DH条件为20%（w/v）GB、136.23 U/mL Neutrase、31 h，预测DH 87.03%。实验DH为78.59%，低于预测但差异不显著（p=0.255）。失拟显著表明预测性能有限。茚三酮法测含氨基化合物而非直接测肽键裂解；因未单独测定未处理GB中氨基贡献，DH应解释为基于测定的水解估计，而非肽键裂解直接定量。DH不提供肽分子量分布或肽身份，需额外肽谱分析。

3.2. Leuconostoc mesenteroides MKJW发酵优化

3.2.1. 发酵模型拟合与统计分析
通过BBD 17 runs，以GB浓度（X₁）、蔗糖浓度（X₂）、发酵时间（X₃）为变量，活菌计数和AGI为响应。活菌模型显著（F=188.57，p<0.0001），解释99.6%变异（R²=0.996，调整R²=0.991）；AGI模型显著（F=14.86，p=0.001），解释95.0%变异（R²=0.950，调整R²=0.886）。两模型均失拟显著（活菌p=0.0006，AGI p<0.0001），表明二次方程未完全解释测试范围响应变异。模型主要用于评价因素效应和识别高响应条件。方程为：活菌计数（log CFU/mL）=9.71+0.09X₁+0.08X₂+2.00X₃?0.03X₁X₂+0.07X₁X₃?0.02X₂X₃?0.02X₁²?0.19X₂²?2.43X₃²；AGI (%)=72.28?2.08X₁+63.22X₂+44.28X₃+0.28X₁X₂+0.62X₁X₃+32.60X₂X₃?13.42X₁²?56.21X₂²?40.66X₃²。活菌模型中发酵时间线性和二次项高度显著（p<0.0001），蔗糖二次项显著（p=0.010），GB和蔗糖线性效应不显著。AGI模型中蔗糖线性和二次项、发酵时间线性和二次项及其交互X₂X₃显著；GB浓度无显著线性、交互或二次效应。失拟可能与非线性或高阶响应有关，微生物发酵涉及时间依赖的细胞生长、底物利用和食品基质生化转化；中心点纯误差小，尤其活菌均方0.0010，即使小偏差也可能显著失拟。

3.2.2. 响应面法分析
通过三维图，活菌计数随GB浓度变化有限，随蔗糖浓度呈曲线响应而非简单线性；随发酵时间沿轴陡升，沿GB浓度轴较平。表明发酵时间是活菌计数主要因素，蔗糖有非线性效应，GB影响有限。AGI图中，GB轴较平而蔗糖轴陡，AGI主要受蔗糖影响；AGI随发酵时间显著增加并有曲率；蔗糖与时间呈圆顶形响应面，与X₂X₃显著及两因素二次效应一致。基于这些响应面进行多响应优化，同时最大化活菌计数和AGI，确定7.1%（w/v）GB、6.7%（w/v）蔗糖、27 h为模型衍生条件。

3.2.3. 模型衍生条件的实验评估
多响应模型衍生条件为7.1%（w/v）GB、6.7%（w/v）蔗糖、27 h。预测活菌9.98 log CFU/mL、AGI 86.57%。实验活菌9.94 log CFU/mL，与预测差异不显著（p=0.249），差0.04 log CFU/mL。实验AGI 92.94%，显著高于预测86.57%（p<0.001）。失拟与验证点差异可共存。活菌和AGI与不同处理变量关联：5%（w/v）GB无添加蔗糖时，活菌0至48 h从5.17增至9.19 log CFU/mL，而AGI为负（?69.54%和?83.36%）；10%（w/v）蔗糖时，AGI从0 h ?31.03%增至48 h 85.56%，说明活菌增加不总伴随AGI增加。AGI可能来自发酵衍生或释放肽，也可能来自微生物代谢物包括有机酸、GB基质或发酵培养基残留可溶成分；L. mesenteroides MKJW可在其他食品底物发酵中产dextran和oligosaccharides，蔗糖衍生碳水化合物也可能贡献，但未确定。发酵上清未中和，酸化也可能贡献。AGI代表体外总体抑制响应，未识别负责化合物。需进一步分级和组成分析，食品安全质量超出本过程优化研究范围。

讨论总结与结论翻译：两个二次模型均存在显著失拟，尤其发酵响应；因此拟合模型应作为测试范围内识别有利加工条件的经验工具，而非精确预测方程。DH基于茚三酮测氨基，不能直接反映肽键裂解，也不提供肽分子量或身份。AGI为发酵上清总体体外抑制，受蔗糖、时间及交互影响，但负责化合物未鉴定，肽、有机酸、残留可溶成分和蔗糖衍生物可能贡献，酸化也可能参与。需进一步分级、组成分析及食品相关安全质量评价。结论：Box–Behnken响应面法用于评价和优化Neutrase介导的GB水解和Leuconostoc mesenteroides MKJW发酵。测试范围内与高预测DH相关的模型衍生水解条件为20%（w/v）GB、136.23 U/mL Neutrase和31 h，实验DH为78.59%。对于发酵，模型衍生多响应条件为7.1%（w/v）GB、6.7%（w/v）蔗糖和27 h，实验活菌为9.94 log CFU/mL，体外AGI为92.94%。本研究提供过程特异定量信息，说明多个相互作用变量对GB的Neutrase介导水解和L. mesenteroides MKJW发酵的影响，并识别经实验评估的操作条件。这些结果为后续组成、机制和功能表征提供基础，但拟合模型应解释为经验优化工具而非精确预测模型。进一步研究应进行肽和代谢物表征，以及食品相关安全性和质量评价，以确定加工GB材料作为食品配料的适用性。