基于M13噬菌体双功能工程化平台的沙门氏菌双模态检测新策略：比色与表面增强拉曼散射信号的协同放大

《Foods》：M13 Bacteriophage-Based Sandwich Assay for Salmonella Detection: A Dual-Signal Approach Combining Colorimetric and SERS Techniques

　　

本文提出了一种基于工程化双功能M13噬菌体的沙门氏菌（Salmonella）双模态检测策略。研究人员将沙门氏菌特异性结合肽融合至pIII衣壳蛋白，同时在pVIII衣壳蛋白表面展示链霉亲和素（streptavidin, SA）结合纳米标签。利用每个噬菌体约2700拷贝的pVIII蛋白优势，通过添加SA-HRP实现大规模酶负载，这一设计成为在TMB底物存在下同时产生表面增强拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering, SERS）信号与比色信号的关键。在优化条件下（37 °C，约1.5 h），比色模式检测限（limit of detection, LOD）达3.4 CFU/mL，SERS模式检测限达2.7 CFU/mL。该方法展现出优异的特异性，并在凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）、牛肉及花生等复杂基质中表现出令人满意的准确性，凸显了其在食品快速安全检测中的实际应用潜力。

一、研究背景与问题提出

食源性致病菌污染是当前全球公共卫生与食品安全领域面临的重大挑战。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）作为最常见的食源性病原体之一，可引发从自限性胃肠炎到严重系统性感染等多种疾病，对公众健康构成显著威胁。传统的沙门氏菌检测手段，包括基于培养的方法、聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）以及酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA），在实际应用中均面临检测周期长、操作繁琐或灵敏度不足等局限，尤其在细菌浓度极低的场景下难以满足快速、超灵敏检测的需求。

现有沙门氏菌检测策略多依赖基于单克隆或多克隆抗体配对的双抗体夹心免疫分析，但此类方法存在抗体生产周期长、成本高昂且筛选过程复杂等固有缺陷。纳米抗体虽作为替代识别探针受到广泛关注，具备高结合亲和力、特异性、结构稳定性及易于基因工程改造等优势，但仅具备识别能力并不足以保证足够的信号输出，可能限制检测灵敏度。因此，开发能够整合特异性分子识别与内源性信号放大功能的新型功能材料具有重要的科学意义与应用价值。

二、研究内容与核心发现

针对上述问题，研究人员构建了一种基于双功能M13噬菌体的SERS-比色双模态传感平台，用于鼠伤寒沙门氏菌的高灵敏定量检测。M13噬菌体是一种长约880 nm、直径约6.5 nm的丝状病毒，其pIII次要衣壳蛋白（每噬菌体3–5拷贝）可通过基因工程手段展示特异性识别沙门氏菌的纳米抗体或多肽，而pVIII主要衣壳蛋白（约2700拷贝/噬菌体）则提供了丰富的N端修饰位点，便于化学修饰与功能化。研究人员将沙门氏菌特异性结合肽（VTPPTQHQ）基因展示于pIII蛋白，赋予其选择性识别能力；同时对pVIII蛋白进行生物素化修饰，使其能够高效锚定链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶（streptavidin-conjugated horseradish peroxidase, SA-HRP），催化TMB底物氧化产生比色信号。由于pVIII蛋白的高拷贝数，每个噬菌体可提供多个酶锚定位点，实现信号放大。此外，磁性金纳米复合材料（MBs@CS@AuNPs）被用作SERS基底，氧化态TMB进一步增强SERS响应，从而实现对同一反应体系比色信号与拉曼信号的同步采集。

研究结果表明，该双模态检测平台在优化条件（37 °C，约1.5 h）下，比色模式检测限为3.4 CFU/mL，SERS模式检测限为2.7 CFU/mL，灵敏度优于多数已报道的检测方法。该方法对鼠伤寒沙门氏菌表现出优异的特异性，并在凡纳滨对虾、牛肉和花生等复杂食品基质中均获得满意的加标回收率，验证了其在实际样品检测中的可靠性与实用性。该平台通过位点定向工程策略，具备良好的可编程性和通用性，可通过更换基因修饰位点或展示的识别元件扩展至其他靶标检测，在食品安全监测、临床即时检测及环境监测等领域展现出广阔的应用前景。

三、关键技术方法

研究人员采用以下核心技术手段构建双模态检测体系：其一，基于M13噬菌体基因工程改造技术，在pIII蛋白展示沙门氏菌特异性识别肽，并在pVIII蛋白展示链霉亲和素结合肽，构建双功能噬菌体探针；其二，采用免疫磁珠（immunomagnetic beads, IMBs）捕获富集技术，将抗沙门氏菌单克隆抗体偶联至磁性纳米珠表面，实现复杂基质中靶标菌的高效磁分离与富集；其三，利用磁性金纳米复合材料（MBs@CS@AuNPs）作为表面增强拉曼散射（SERS）活性基底，通过外部磁场实现纳米材料的聚集与信号增强；其四，构建"IMBs-靶细菌-M13噬菌体"三明治夹心结构，借助SA-HRP催化TMB氧化，同步产生比色信号与SERS信号，实现双模态交叉验证。实验所用菌株均来源于研究团队实验室，食品样品（凡纳滨对虾、牛肉、花生）购自当地市场并经平板计数法确认无菌。

四、研究结果

4.1 检测原理验证

研究人员系统验证了IMBs-细菌-噬菌体"三明治"结构的双信号检测原理。紫外-可见吸收光谱显示，含"三明治"结构的反应体系在641 nm处呈现显著的吸收峰，对应蓝色氧化态TMB（ox-TMB）的生成，而五种对照体系在该波长处无明显吸收峰，证实"三明治"结构能有效促进TMB氧化。拉曼光谱分析同样表明，仅含"三明治"结构的体系在1602 cm^?1处呈现强烈的ox-TMB特征拉曼峰，对照体系仅显示微弱背景信号。透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）表征确认了IMBs成功捕获沙门氏菌并在菌体表面形成明显的噬菌体层，证实"三明治"结构的成功构建。

4.2 检测条件优化

研究人员系统优化了关键反应参数。在"一锅法"反应时间优化中，比色响应、拉曼信号强度及捕获效率均在80 min时达到最大值，故确定80 min为最优反应时间。TMB显色时间优化显示，641 nm处吸光度在16 min时达到峰值后逐渐下降，因此选择15 min作为比色检测最优显色时间；而1602 cm^?1处拉曼强度随时间持续增加但增幅渐缓，故确定20 min为SERS检测最优反应时间。温度优化实验表明，37 °C时比色响应、拉曼信号强度及捕获效率均达到最高，确定37 °C为最优反应温度。

4.3 特异性评价

特异性实验采用1 × 10⁴ CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌与1 × 10⁵ CFU/mL的干扰菌株（大肠杆菌O157:H7、大肠杆菌ER2738、假单胞菌、希瓦氏菌）进行对比。结果显示，反应体系仅对鼠伤寒沙门氏菌产生显著响应，对其他菌株无明显信号，证实该方法具有优异的检测特异性。

4.4 灵敏度与线性范围

在比色模式下，随着鼠伤寒沙门氏菌浓度从4 × 10¹至4 × 10⁷ CFU/mL递增，641 nm处吸光度逐渐增大，溶液颜色由无色渐变为蓝色。校准曲线拟合为y = 0.06377x + 0.11459（R² = 0.98486），检测限（limit of detection, LOD）为3.4 CFU/mL。在SERS模式下，1602 cm^?1处拉曼强度随菌浓度增加呈规律性变化，校准曲线拟合为y = 218.11818x ? 222.05661（R² = 0.98133），检测限为2.7 CFU/mL。

4.5 重现性与可靠性验证

研究人员从样品表面随机采集30个不同位置的拉曼光谱，三维瀑布图显示信号高度均匀，1602 cm^?1峰强度的相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）约为13.47%，表明"三明治"结构具备良好的检测重现性。针对超低浓度（3.0 CFU/mL）鼠伤寒沙门氏菌的验证实验中，SERS定量结果（0–2.35 CFU/mL）与平板计数法结果（0–4.2 CFU/mL）具有良好一致性，证实SERS模式可实现单位数CFU水平的稳定可靠检测。

4.6 稳定性评价

储存稳定性实验显示，"三明治"结构在4 °C储存14天后，其酶催化活性仍保留约80%的初始比色响应与SERS强度，表明该方法具备良好的储存稳定性。

4.7 实际样品验证

在凡纳滨对虾、牛肉和花生三种真实食品基质中进行加标回收实验。比色模式下，三种基质中的加标回收率分别为98.8%–122.4%、98.4%–119.6%和97.4%–110.4%，变异系数（coefficient of variation, CV）分别为12.42%–19.97%、6.13%–14.79%和8.76%–15.94%。SERS模式下，回收率分别为99.6%–108.6%、109.0%–120.8%和99.6%–115.2%，CV分别为7.65%–18.99%、5.27%–12.80%和4.90%–10.47%。上述结果证实该方法在复杂食品基质中具备较高的分析准确度。

五、讨论与结论

本研究通过引入双功能M13噬菌体，实现了对鼠伤寒沙门氏菌的特异性识别与酶负载的同步放大，结合磁分离免疫分析与双信号读出（比色与SERS），使检测灵敏度达到单细菌水平。该位点定向工程策略赋予平台良好的可编程性和通用性，通过更换基因修饰位点或展示的识别元件，可扩展至其他靶标的检测。研究结论指出，该方法在食品安全监测（如乳制品、蛋类、肉类及即食食品）、临床诊断（如粪便和血液样本的即时检测）以及环境监测（如饮用水和水产养殖系统）等领域具有广阔的应用前景。尽管总检测时间约为1–2 h，但实际操作时间显著缩短，适用于资源有限环境下的常规筛查。研究同时指出当前存在的局限性，包括空间位阻效应需通过精确测定每个M13噬菌体上SA-HRP的负载数量来量化信号放大倍数，以及针对其他沙门氏菌血清型的特异性问题，这些将在后续研究中进一步探讨。