基于片段特异性稳定碳同位素分析的红曲米产品真实性筛查方法研究

《Foods》：Fragment-Specific Stable Carbon Isotope Analysis for Screening the Authenticity of Red Yeast Rice Products

　　

红曲米中的莫纳可林K（Monacolin K，MK）在其内酯形式上与药物洛伐他汀结构相同，使得二者的来源难以区分。本研究利用液相色谱-同位素比质谱法（LC-IRMS），考察了水解衍生得到的2-甲基丁酸（2-methylbutyric acid，2-MBA）的δ13C值作为片段特异性筛查标志物的可行性。日内重复性对于红曲米为0.19‰，实验室间标准偏差为0.18–0.19‰，双分量扩展不确定度估计值为±0.58‰（k = 2）。在45份真实红曲米样品中，水解衍生的2-MBA的δ13C值范围为?32.73‰至?26.68‰，而在23批药物洛伐他汀中则为?10.17‰至?6.87‰。受控混合实验显示，δ13C值与混合比例呈线性关系（R2 = 0.9997）。在95%置信度和99%总体覆盖率的条件下，单侧容差限给出了针对所取样的中国真实红曲米总体的调查性筛查阈值为?26.47‰。在所检测的20种商业产品中，有3种超过了该阈值，因此被归类为与该总体同位素不一致。总体而言，本研究开发并分析评估了一种片段特异性的LC-IRMS方法，用于在所研究的条件下筛查红曲米来源的MK与药物洛伐他汀之间的来源相关同位素差异，从而为红曲米真实性评估提供了一种潜在的分析工具。

红曲米产品真实性筛查：基于片段特异性稳定碳同位素分析的LC-IRMS方法研究

一、研究背景与研究目的

红曲米是通过将蒸熟的米饭接种紫红曲霉发酵而成的传统食品，其降胆固醇活性主要归因于莫纳可林K。MK在体内以羟基酸和内酯两种形式存在，其中内酯形式在结构上与药物洛伐他汀完全一致。这种结构上的同一性给市场监管带来了巨大挑战：常规的分子鉴定方法无法区分天然发酵产生的MK与非法添加的药物洛伐他汀。由于不同生产批次间的天然MK含量差异显著，不法厂商可能通过添加药物洛伐他汀来提高产品中的有效成分含量以达到标签声称值，这构成了经济驱动的食品掺假行为，可能导致消费者在不知情的情况下摄入处方剂量的药物。因此，亟需一种能够可靠区分MK来源的分析方法，以服务于食品安全与药品监管。

二、主要技术方法

研究人员采用了液相色谱-同位素比质谱联用技术进行片段特异性稳定碳同位素分析。样品前处理包括：采用6 mol/L盐酸在65°C下对红曲米样品进行水解12小时，使MK/洛伐他汀的酯键断裂，释放出2-甲基丁酰基侧链形成游离的2-MBA；随后用乙醚进行液液萃取，经碱化、酸化等净化步骤后，使用配备HyperREZ XP Carbohydrate H+色谱柱的LC-IRMS系统进行在线分离与δ¹³C测定。此外，还使用了元素分析-同位素比质谱法对完整洛伐他汀工作标准进行测定，以验证其与水解衍生2-MBA的同位素关系。研究涉及的样品包括来自中国10家制造商的45份真实红曲米样品，以及从安徽、江苏、山东、四川和河南药店采购的23批药物洛伐他汀产品。

三、主要研究结果

3.1 水解-萃取流程的开发

研究人员开发了一套完整的样品前处理流程，以实现2-MBA的有效回收并获得可用于同位素分析的色谱峰。实验表明，乙醚的提取效率优于MTBE或正己烷，两次连续乙醚萃取的平均回收率估计值为97.6%。色谱选择性验证显示，2-MBA标准品、洛伐他汀水解产物和红曲米水解产物中的目标峰具有一致的保留时间，且在2-MBA区域无干扰峰。

3.2 LC-IRMS方法的分析性能

3.2.1 精密度与重现性

仪器稳定性测试显示，十次连续CO₂注射的标准偏差为0.026‰。六次独立重复测量给出红曲米的日内重复性为0.19‰，药物洛伐他汀为0.05‰。三天内的日内重现性标准偏差为0.29‰。在三家实验室间的比对中，标准品和两种市售红曲米材料的实验室间标准偏差为0.18–0.19‰。

3.2.2 前处理对同位素测量的影响

两种2-MBA工作标准品在前处理前后的δ¹³C值变化分别为?0.17‰和+0.06‰，表明在当前前处理条件下未观察到明显的同位素偏移。五种洛伐他汀工作标准品的完整分子EA-IRMS测量值与水解衍生2-MBA的LC-IRMS测量值呈现强相关性（R² = 0.9976），表明标准品间的相对同位素差异在2-MBA片段中得到保留。

3.2.3 实验室制备混合物的质量平衡预测一致性

五种2-MBA与洛伐他汀工作标准品混合物的实测δ¹³C值与质量平衡预测值的绝对偏差为0.13–0.34‰（R² = 0.9985），配对比较未发现统计学显著的均值残差。

3.2.4 测量不确定度

基于GUM方法计算的双分量扩展不确定度为±0.58‰（k = 2），包含日内重现性分量和IAEA-CH-6参考物质赋值不确定度分量。

3.3 基于2-MBA δ¹³C分析的红曲米产品同位素筛查

3.3.1 真实红曲米与药物洛伐他汀的同位素区分

45份真实红曲米样品的水解衍生2-MBA δ¹³C值范围为?32.73‰至?26.68‰（均值±标准差为?29.74 ± 1.13‰），而23批药物洛伐他汀的范围为?10.17‰至?6.87‰（?8.33 ± 0.80‰），两组数据无重叠。

3.3.2 群体特异性筛查阈值的选择

基于45份真实红曲米样品的正态性检验结果，研究人员采用单侧参数上容忍限作为筛查边界。在95%置信度下，针对99%总体覆盖率的单侧上容忍限为?26.47‰，被选为调查性筛查阈值。敏感性分析表明，该阈值对上尾观测值较为敏感，接近边界的检测结果需谨慎解读。

3.4 真实红曲米与药物洛伐他汀的受控混合实验

研究人员制备了真实红曲米样品R26与洛伐他汀-糊精粉末LD1的不同质量比混合物。所有八个混合水平的实测δ¹³C值呈现线性响应（R² = 0.9997），与质量平衡预测值的绝对偏差为0.11–0.21‰。基于同位素质量平衡估算，当洛伐他汀贡献约15%（基于均值端元值）或约18%（基于R26-LD1对）的可水解2-甲基丁酰基池时，会超过?26.47‰阈值。

3.5 商业红曲米产品的应用

在20种商业红曲米产品中，17种低于筛查阈值。三种产品C10、C14和C15的δ¹³C值分别为?19.89‰、?18.31‰和?15.93‰，超过了阈值，被归类为相对于所调查的中国真实红曲米群体的筛查阳性。产品C09仅低于阈值0.25‰，处于双分量扩展不确定度范围内，需额外证据进行分类。

四、讨论与结论

研究人员指出，真实红曲米与药物洛伐他汀群体间的平均δ¹³C差异约为21‰，这一偏移与原料碳源的差异相符：红曲米的发酵底物大米属于C3植物，其δ¹³C值通常落在?35‰至?20‰区间，而药物洛伐他汀的值则位于或部分高于C4植物的典型范围（?19‰至?9‰）。然而，由于无法获取发酵底物和生产记录，这一解释仅为推断而非对生产来源的确凿归因。

本研究的参考集涵盖了中国10家制造商，但地理分布不均，浙江提供了45份真实样品中的25份。尽管制造商和省际分析未检测到统计显著的组间差异，但更广泛的应用仍需更大地理范围的取样、更均衡的批次和制造商分布、独立的阈值验证，以及涵盖多种基质和来源的受控混合实验。

研究结论认为，该片段特异性LC-IRMS工作流程能够在所研究的条件下用于测量红曲米产品中水解衍生2-MBA的δ¹³C值。其精密度、实验室制备混合物的一致性以及实验室间比对结果支持其分析用途。真实红曲米与药物洛伐他汀样品具有不同的同位素分布，受控混合实验显示出预期的混合响应。?26.47‰的边界为所调查的中国真实红曲米参考群体提供了一个调查性筛查工具，超出该阈值表示同位素不一致，但不能确认掺假。该阈值在更广泛应用前，需要在更多参考群体、基质和洛伐他汀来源中进行独立验证。