食品安全中主要产毒真菌及其毒素的检测：传统平台与免疫诊断平台的进展与未来方向

《Foods》：Conventional and Immunodiagnostic Platforms for the Detection of Major Mycotoxigenic Fungi and Their Toxins for Food Safety

　　

产毒真菌（mycotoxigenic fungi）污染谷物、坚果、水果和其他食品商品，威胁人类和动物健康。本综述聚焦于作为代表性产毒真菌（mycotoxigenic fungi）的黄曲霉（Aspergillus flavus）、轮枝镰刀菌（Fusarium verticillioides）和互隔链格孢（Alternaria alternata），因为它们是重要的食品污染物并产生与食品相关的主要真菌毒素（mycotoxins）。一些方法检测真菌存在或产毒潜力，而另一些方法直接定量毒素。真菌鉴定或生物合成基因检测分别指示存在或产毒潜力，但二者均不能替代直接的真菌毒素测量。目标、毒素和食品基质的多样性仍是准确且实用分析的挑战。特别关注免疫诊断方法，包括酶联免疫吸附测定（ELISAs）以及侧向层析免疫分析（LFIAs）和免疫传感器（immunosensors）等补充形式，用于实验室和现场食品安全监测。讨论了这些方法的优势和局限，重点涉及灵敏度、特异性、基质效应和样品前处理。未来将聚焦于整合的、经基质验证的工作流程，结合稳健的样品前处理、多重识别、便携式读出和适当的质量控制，从而实现贯穿食品和饲料链的更快、更可靠的真菌污染和真菌毒素监测。

1. 引言：产毒真菌（mycotoxigenic fungi）威胁全球食品安全。曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）和链格孢属（Alternaria）是主要产毒真菌。A. flavus 产生黄曲霉毒素（AFs），尤其 AFB₁，为1类致癌物；F. verticillioides 产生伏马菌素（FUM）；F. graminearum 产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN）；A. alternata 产生交链孢酚（AOH）等新兴毒素。真菌生长不等于毒素污染。欧盟 Regulation (EU) 2023/915 规定主要毒素限量。本综述重点免疫诊断平台及纳米材料、多重和人工智能（AI）辅助判读。

2. 传统平台：培养回收活真菌；聚合酶链反应（PCR）检测DNA；生物合成基因指示产毒潜力而非毒素；色谱法测定毒素；光谱筛查检测商品变化。各终点不能相互替代。

2.1 表型鉴定：综合菌落、显微形态、生长和生理特征。培养计数含取样、匀浆、稀释、选择培养基、培养和计数。A. flavus、A. alternata、F. verticillioides 在培养基上菌落特征不同。培养可保存活菌株，但计数受培养基、水活度、温度等影响，形态鉴定主观且难区分近缘种。

2.2 传统和实时PCR：PCR可在可见生长前检测DNA，但灵敏度依赖取样、提取、生物量和抑制剂，且不区分死活。标记包括 ITS1/ITS2、gpd、Alt a 1。常规、多重、实时定量和数字PCR已用于食品真菌检测。靶向生物合成基因只指示潜力。

2.3 色谱和光谱：薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）、超高效液相色谱（UHPLC）及荧光、紫外（UV）、二极管阵列（DAD）、质谱（MS）检测器用于毒素分析；LC-MS/MS 是多毒素同时测定首选。光谱如紫外-可见（UV-Vis）、荧光、傅里叶变换红外（FTIR）、近红外（NIR）和拉曼提供补充信息，但需校准和独立基质验证。

3. 免疫诊断平台：通过抗体等识别真菌结构或产物。真菌抗原可用夹心形式，小分子毒素用竞争形式。ELISA、LFIA广泛用于筛查，免疫传感器提供其他形式。抗原-抗体（Ag-Ab）结合转为比色、荧光、光学或电化学信号。

3.1 抗体方法：抗体（Ab）与抗原（Ag）或表位特异结合。真菌靶标包括孢子壁、菌丝、胞外多糖、蛋白和毒素。小分子毒素需偶联蛋白形成免疫原。多克隆抗体（pAb）和单克隆抗体（mAb）各有优劣；鸡源免疫球蛋白Y（IgY）可非侵入性获取。LOD 和 LOQ 是整个分析系统性能，商业试剂盒优势在快速、简单、便携和低成本，可疑结果需色谱确认。

3.1.1 ELISA：ELISA基于酶标记抗体与抗原结合显色。夹心适合大分子抗原，竞争用于小分子毒素。已用于 AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂、AFM₁、OTA、DON、ZEN、FB₁、FB₂、棒曲霉素、T-2/HT-2 和交链孢酚等。真菌抗原阳性不能解释为毒素浓度。重组抗体和纳米抗体仍需评价，ELISA适合常规筛查。

3.1.2 LFIA和流通免疫分析：LFIA基于固相色谱和Ag-Ab反应。夹心随抗原增加信号增强，竞争随毒素增加信号降低。金纳米颗粒等报告物支持视觉或读数检测。已开发多重LFIA同时检测 AFB₁、T-2、ZEN、DON、FB₁ 等，检出限随分析和基质变化。流通免疫分析垂直通过膜，可缩短孵育并支持多重。

3.1.3 光学免疫诊断平台：荧光免疫分析（FIA）和化学发光免疫分析（CLIA）分别用荧光和化学发光信号，具有高灵敏和宽动态范围潜力。性能受抗体、交叉反应和基质干扰影响。与便携读数器、智能手机和微流控结合利于现场定量。

3.1.4 免疫传感器：免疫传感器在同一平台完成识别和信号转换，分电化学、光学和压电型。用于 AFB₁、OTA、FUM、DON、ZEN、T-2 和棒曲霉素等。表面等离子体共振（SPR）和电化学阻抗谱（EIS）等可多重或无标记检测。挑战包括稳定性、基质干扰、表面再生和现场转化。

4. 基于适配体的识别和适配体传感器：适配体（aptamer）是单链DNA（ssDNA）或RNA寡核苷酸，通过 SELEX 筛选，具高特异性和亲和力。已用于 AFs、OTA、FUM、ZEN 和 T-2 毒素，适配体传感器采用电化学、光学和光电化学转导，纳米材料增强信号。直接检测产毒真菌仍有限，识别孢子或β-葡聚糖不证明活力和产毒。

5. 基于成像的检测和人工智能：多光谱成像（MSI）和高光谱成像（HSI）结合空间与光谱信息。研究用 HSI/NIR 预测玉米 DON、伏马菌素或小米污染指标，但需独立样品和自然污染验证；RGB 和病害分类不等同毒素定量。便携荧光和智能手机读数可支持筛查，但验证需覆盖完整读数器和分析。AI 模型需独立测试，避免重复扫描泄漏。

6. 样品前处理：样品前处理决定回收率、基质效应和 LOD。必须代表性取样，并针对核酸、抗原或毒素设计提取。真菌细胞壁和食品基质复杂性影响分析性能。

6.1 真菌结构和裂解要求：细胞壁含几丁质、葡聚糖、甘露聚糖、蛋白和黑色素，不同菌种和发育形式抗性不同。休眠、色素化孢子较难破碎，疏水孢子易聚集。DNA 提取效率随种类和形态变化；抗原提取需单独评价，ELISA 信号不能视为活菌计数。

6.2 基质复杂性和抑制：谷物、种子和水果含淀粉、蛋白、脂质、果胶、色素和酚类，可影响核酸、抗原和信号。改良 CTAB 加 PVP/PVPP 可改善核酸回收。免疫分析应用基质匹配或加标样品评价。

6.3 代表性取样和匀浆：污染分布高度异质，取样和二次取样是变异来源。足够样品质量、增量取样、混合和匀浆必要。匀浆降低空间异质性，裂解释放胞内靶标；完整孢子分析需保留识别表面。

6.4 化学和酶裂解：化学裂解用 SDS 或 CTAB 结合蛋白酶 K，必要时加 PVP 或还原剂。酶处理温和但需测量对抗原影响。因细胞壁变异，酶处理宜作补充裂解。

6.5 机械破碎和珠磨：珠磨适合耐裂解真菌，可标准化且可重复，效率受珠、条件、菌种和基质影响。可改善 Aspergillus DNA 回收，但过度处理导致 DNA 剪切，需优化。

6.6 粗提物和真菌毒素净化：粗提物适合高浓度定性筛查，稀释可降低抑制剂但也降低目标。低污染或定量需求时需净化。QuEChERS、固相萃取（SPE）和免疫亲和柱（IAC）各有覆盖和损失风险。稀释进样保留广覆盖但受基质抑制。净化应据分析物和基质选择。

6.7 整合样品前处理和检测：前处理和检测应作为单一工作流。质量控制覆盖匀浆到检测，包括过程控制、空白、基质匹配对照和内部对照。验证应使用纯化、加标和自然污染样品，检查试剂批次、储存和独立实验室重复性。

7. 未来展望：未来趋向快速、便携和现场可部署诊断。重点包括同时检测真菌标志物和毒素的多重/多模态平台，光学和电化学转导，纳米材料增强，适配体筛选和 AI 辅助信号处理。主要挑战是将概念验证转化为在多样基质、自然污染样品和实验室间验证的可靠应用，并与参考方法和法规协调。

8. 结论：快速可靠检测产毒真菌和毒素对食品安全监测至关重要。培养、分子、生物合成基因、毒素和抗原检测回答不同问题，不能互相替代。亲和力平台在快速筛查有优势，但样品前处理仍是瓶颈。未来应连接代表性取样、提取和验证检测，并加强对照和便携读出，以支持需求点检测。