黑参-鹿茸肽复合乳液的体外抗黑色素生成与抗氧化作用研究

《Foods》：Black Ginseng–Deer Antler Peptide Composite Emulsion: Antimelanogenic and Antioxidant Effects In Vitro

　　

本研究旨在开发一种具有抗黑色素生成和抗氧化活性的黑参-鹿茸肽复合乳液（black ginseng–deer antler peptide composite emulsion, BGD），并探讨其潜在生物学效应。研究人员通过响应面法（response surface methodology, RSM）优化BGD配方，随后评估其理化特性、稳定性、初步皮肤安全性及体外抗氧化能力。分别采用α-黑色素细胞刺激素（α-melanocyte-stimulating hormone, α-MSH）诱导的黑色素生成模型和过氧化氢（H2O2）诱导的氧化应激模型，在B16F10细胞中进一步研究其抗黑色素生成和抗氧化作用。BGD表现出良好的稳定性，未观察到明显的皮肤刺激，并展现出体外抗氧化活性。BGD可抑制细胞酪氨酸酶（tyrosinase, TYR）活性（4.86%–35.82%）和黑色素生成（17.54%–45.29%），伴随小眼畸形相关转录因子（microphthalmia-associated transcription factor, MITF）、酪氨酸酶和多巴色素异构酶（dopachrome tautomerase, DCT）表达下降（p < 0.01）。此外，BGD上调核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）、血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）和NAD(P)H:醌氧化还原酶1（NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1, NQO1）的表达，同时下调Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1）的表达（p < 0.01）。BGD还降低了细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平，并改善了与氧化还原失衡相关的生化指标（p < 0.01），提示其可能通过调控Nrf2/Keap1通路缓解H2O2诱导的细胞氧化应激。

一、研究背景与目的

皮肤是抵御外界环境侵害的重要屏障。长期暴露于紫外线照射、大气污染物等外部应激源，可破坏皮肤稳态，诱发一系列细胞和组织损伤，进而导致皮肤老化和色素沉着。这些外界刺激可促进皮肤细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）的生成。当ROS积累超过内源性抗氧化系统的清除能力时，细胞氧化还原稳态被破坏，引发氧化应激。持续氧化应激可损伤细胞生物大分子，诱导炎症反应和细胞功能障碍，最终加速皮肤老化。同时，环境侵害还会干扰皮肤正常的色素代谢，导致黑色素过度生成和沉积，形成皮肤色素沉着。黑色素的生成受多种信号分子、转录因子和黑色素生成酶的调控，其中小眼畸形相关转录因子（microphthalmia-associated transcription factor, MITF）在色素生成调控中发挥关键作用，酪氨酸酶（tyrosinase, TYR）是黑色素生成的核心酶，多巴色素异构酶（dopachrome tautomerase, DCT）参与黑色素生成过程中中间产物的转化。

黑参是传统人参经反复蒸制和干燥工艺加工而成的产品，富含稀有皂苷、多糖、酚类化合物等生物活性成分，具有抗氧化、抗炎和抗衰老等活性。鹿茸是雄性梅花鹿或马鹿未骨化或未完全骨化的嫩角，鹿茸肽是从鹿茸中提取的生物活性肽，具有抗氧化、抗衰老、促进细胞增殖和组织修复等特性。已有研究表明，红参和鹿茸提取物的联合使用比单独使用能提供更强的抗中波紫外线（UVB）皮肤损伤保护作用。鉴于黑参与鹿茸肽具有不同的化学成分和互补的生物活性，二者联合使用可能为皮肤护理应用提供基础。然而，黑参提取物和鹿茸肽能否制备成稳定的复合乳液，以及所得配方是否具有抗氧化和抗黑色素生成活性，尚未得到系统研究。因此，本研究以黑参提取物和鹿茸肽为主要功能成分制备BGD，系统评价其理化性质、抗氧化活性和抗黑色素生成活性，并进一步探讨其潜在作用机制。

二、主要研究方法

研究人员采用Box–Behnken响应面设计优化BGD配方，以黑参-鹿茸肽复合物添加量、丁二醇和橄榄仁油添加量为自变量，以乳液感官评分为响应值。制备工艺为：水相含黑参-鹿茸肽复合物、丁二醇和去离子水，油相含橄榄仁油、氢化聚异丁烯和鲸蜡醇乙基己酸酯，两相加热至75℃后高速均质乳化。理化性质测定包括pH值、质构特性（硬度、稠度、内聚性和内聚功）、稳定性（40℃和-20℃热冷稳定性、离心稳定性）以及人体斑贴试验（30名18-30岁志愿者）。体外抗氧化活性通过DPPH·、ABTS⁺、·OH自由基清除实验和FRAP总抗氧化能力实验评价。细胞实验中，采用α-MSH诱导的B16F10细胞黑色素生成模型和H₂O₂诱导的氧化应激模型，通过CCK-8法检测细胞活力、黑色素含量测定、酪氨酸酶活性测定、DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平、生化试剂盒检测SOD、CAT、MDA和GSH水平，以及Western blot检测黑色素生成相关蛋白（MITF、TYR、DCT）和氧化应激相关蛋白（Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1）的表达。

三、研究结果

1. 1.
   BGD配方优化结果

响应面模型的方差分析显示模型F值为105.40（p < 0.001），失拟项不显著（p > 0.05），表明模型拟合良好。三个因素对感官评分的影响顺序为橄榄仁油（C）> 丁二醇（B）> 黑参-鹿茸肽复合物（A）。模型预测的最优配方为3.0%黑参-鹿茸肽复合物、2.0%丁二醇和1.3%橄榄仁油，预测感官评分为37.2，验证实验实际感官评分为38.5 ± 1.35，相对差异为3.49%，验证了模型的预测性能。

1. 2.
   BGD理化性质与安全性

BGD表现出良好的质构特性，pH值接近人体皮肤正常生理pH范围。离心处理和24小时热冷处理后均未观察到相分离或破乳现象，表明BGD在测试条件下具有良好的物理稳定性。斑贴试验中，30名参与者在斑贴去除后0.5、24和48小时均未出现皮肤刺激或其他不良反应，表明BGD具有良好的皮肤相容性。

1. 3.
   BGD体外抗氧化活性

BGD在测试稀释范围内对DPPH·、ABTS⁺和·OH均表现出清除活性，且清除率随稀释倍数降低而增加，呈浓度依赖性。最高清除率分别为DPPH 90.60 ± 3.53%、ABTS⁺ 94.38 ± 2.73%、·OH 86.57 ± 2.47%。在稀释倍数为1时，BGD的FRAP值最高，为6.514 ± 0.072 mmol/L。整体而言，BGD表现出较强的自由基清除活性和还原能力。

1. 4.
   BGD对B16F10细胞黑色素生成的影响

细胞活力实验表明，BGD浓度在6 mg/mL以下时细胞活力保持在90%以上，8 mg/mL时出现明显细胞活力下降。因此选择1、3、6 mg/mL进行后续实验。α-MSH刺激显著增加细胞黑色素含量和酪氨酸酶活性，BGD处理以浓度依赖方式逐渐减弱这两种反应。在6 mg/mL浓度下，BGD对黑色素生成的抑制率为45.29%，对酪氨酸酶活性的抑制率为35.82%，与熊果苷（Arbutin）组无显著差异。

1. 5.
   BGD对黑色素生成相关蛋白的影响

Western blot结果显示，α-MSH刺激显著升高MITF、TYR和DCT蛋白表达水平，BGD处理以浓度依赖方式抑制这些蛋白的表达。这表明BGD的抗黑色素生成作用可能与下调MITF及其下游黑色素生成相关蛋白的表达有关。

1. 6.
   BGD对氧化应激的影响

研究人员首先确定了H₂O₂诱导氧化应激模型的条件为1.5 mmol/L H₂O₂处理4小时。H₂O₂刺激显著降低细胞活力，BGD处理显著改善细胞活力。DCFH-DA荧光探针检测显示，H₂O₂暴露显著增加细胞内ROS水平，BGD处理显著降低荧光强度和细胞内ROS水平。生化指标检测显示，高剂量BGD显著升高CAT和SOD活性及GSH水平，显著降低MDA水平。

1. 7.
   BGD对Nrf2/Keap1信号通路的影响

Western blot分析显示，H₂O₂暴露导致Nrf2蛋白表达显著降低，HO-1和NQO1表达下降，Keap1表达升高。与H₂O₂组相比，BGD处理以剂量依赖方式降低Keap1表达，同时促进Nrf2、HO-1和NQO1表达。这表明BGD的抗氧化作用可能与调节Nrf2/Keap1信号通路有关。

四、讨论与结论

讨论部分指出，BGD的抗氧化活性可能来源于黑参和鹿茸肽中多种抗氧化活性成分。BGD的抗黑色素生成作用涉及酪氨酸酶活性抑制和黑色素生成相关蛋白表达的调控。BGD的抗氧化保护作用涉及减少ROS积累、增强内源性抗氧化防御和减轻脂质过氧化。BGD通过下调Keap1表达、上调Nrf2及其下游抗氧化蛋白HO-1和NQO1的表达来增强细胞抗氧化能力。此外，细胞氧化还原状态的变化可能与黑色素生成相关，抗氧化活性和黑色素生成调控可能并非完全独立。

研究结论：本研究成功制备了含3%黑参-鹿茸肽复合物、2%丁二醇和1.3%橄榄仁油的优化配方BGD，该乳液具有良好的稳定性，参与者评估中未观察到明显的皮肤刺激。BGD通过DPPH·、ABTS⁺和·OH清除活性及铁还原能力表现出抗氧化活性。BGD可能通过调节Nrf2/Keap1信号通路缓解细胞氧化应激，并通过调控MITF介导的黑色素生成发挥抗黑色素生成作用。总体而言，BGD表现出初步的体外抗氧化和抗黑色素生成效果，在化妆品和功能性护肤产品中具有潜在应用价值，为黑参-鹿茸肽复合乳液的进一步研究提供了实验依据。