《Drug Delivery》：Overcoming the nuclear barrier in nonviral gene therapy: mechanisms, carrier design, and translational perspectives on NLS peptide and DNA targeting sequence strategies
将质粒DNA（pDNA）高效递送至细胞核仍是非病毒基因治疗的主要瓶颈，尤其在分裂后及缓慢分裂细胞中，核膜构成被动进入的永久性屏障。本综述考察主动核靶向的两大策略：核定位信号（NLS）肽，其将importin-α/β受体直接募集至DNA货物；以及DNA核靶向序列（DTS），其利用携带NLS的转录因子介导“搭便车”式核输入。研究人员并非重新编目核输入生物学，而是聚焦于每种策略成功或失败的条件，并纳入核孔复合体（NPC）结构及通透性、karyopherin-FG-nucleoporin静电作用以及细胞质约束（如屏障自整合因子（BAF）介导的外源DNA聚集）方面的进展。将NLS类别与通用型（SV40增强子）、诱导型（NF-κB）和组织特异性（SMGA、SP-C、T1α）DTS元件进行比较，并在肽基、聚合物基和脂质基纳米组装体中评估四种化学偶联策略。针对当前临床pDNA项目中NLS/DTS机制近乎缺失的问题，研究人员提出核可及性指数（NAI）：一个整合细胞分裂状态、载体-DNA可及性和细胞内信号背景的三轴框架。将NAI视为轴向量而非加和评分，可界定设计空间中的允许、条件和排除区域。实践中有两类重要情形：其一，高度增殖细胞使主动靶向变得冗余；其二，限速问题在于载体工程而非添加信号。NAI为核靶向纳米载体提供设计原则，并界定具有治疗相关性的主动输入的前提条件。
1. Introduction
pDNA递送至细胞核是临床基因治疗和DNA疫苗的主要障碍，尤其分裂后或缓慢分裂组织中核膜完整，pDNA主要经NPC或罕见有丝分裂进入，仅约1–5%非病毒DNA到达细胞核。核输入是多数治疗相关非分裂靶点的限速步骤，导致高剂量、反应变异和瞬时表达。细胞周期是关键决定因素：分裂细胞在核膜解体时允许大质粒被动进入，而神经元和心肌细胞等静息组织依赖主动转运。安全性方面，质粒设计为染色体外，监管预期整合率低于自发突变率；但电穿孔轻度增加整合风险，未甲基化CpG基序和胞质双链DNA可激活TLR9和cGAS-STING。NPC功能孔径约5–9 nm，近期结构研究显示NPC可扩张和收缩，通道宽度和静电选择性决定通透性，karyopherin与FG-nucleoporin网静电作用是选择性转运关键。BAF在胞质结合外源DNA并交联成簇，VRK1共递送降低BAF聚集却降低报告基因表达，提示胞质DNA可用性并非单调决定因素。NLS肽利用经典importin-α/β，单一位点特异性NLS可提高表达达约1000倍，但范围10–1000倍，治疗相关分裂后环境处低端。DTS利用转录因子介导搭便车入核。本综述聚焦pDNA，区别于其他核靶向综述，涵盖DTS、临床pDNA项目及NAI决策框架。
2. NLS peptide-mediated nuclear targeting
2.1 Classical NLS motifs: monopartite and bipartite signals
经典NLS（cNLS）包括单片段和双片段，由importin-α识别，结合importin-β形成转运复合体停靠NPC。原型为SV40大T抗原PKKKRKV，核质蛋白为双片段。碱性侧链占据armadillo重复口袋，单残基替换显著降低转运。粗粒化模型提示karyopherin电荷和FG-nucleoporin静电性质共同限制易位动力学。单共价NLS使3.3-kb质粒表达在非分裂原代细胞约10倍至快速分裂细胞约1000倍增加，治疗相关分裂后环境处低端。双片段作为DNA递送元件验证较少。CPP/DNA/SV40-NLS三重复合物在衣藻中实现核基因递送。
2.2 Non-classical and importin-β-direct signals
若干信号绕过importin-α。hnRNP A1 M9域由transportin（importin-β2）识别；IGFBP3 C端碱性区直接结合importin-β；importin-β结合（IBB）域偶联质粒DNA在脂质复合物中约20倍转染增加。此类提供受体冗余，但M9和IBB不天然结合核酸，DNA附着需另工程设计。IGFBP3衍生肽与壳聚糖/pDNA复合或共价连接约2倍增益，IGFBP5衍生肽未重现。
2.3 Protein-derived polybasic motifs used for carrier functionalization
组蛋白H3/H4 N端尾部由importin-4导入，H3/PEI杂合体转染更多细胞，importin-4敲低降低核定位和染色质沉积约4倍。HMGB1作为DNA结合和弯曲桥，约2.6–4.9倍增益，其核定位区受乙酰化和磷酸化调节。流感B核蛋白KRTR、FGF3衍生24-mer等嫁接于PAMAM等载体，增益反映功能化颗粒整体行为。
2.4 Engineered, multivalent and screening-derived designs
多价和杂交设计如TAT-SV40增加局部碱性电荷密度，报告约200倍荧光素酶表达增加。Tat介导核进入对WGA不敏感、不依赖ATP，可携带大于90 nm货物，处于膜转位与受体介导转运灰区。DNA-PepTAG系统可独立变化NLS身份、连接长度和价数，在生长停滞细胞中NLS修饰使核定位、mRNA转录和eGFP表达提高约10倍，PLSCR1衍生序列和extSV40表现良好。历史不一致可视为化学问题。光可裂解保护基可时空控制入核。
2.5 Transcription factor NLSs: mechanistic bridge to DTS
DNA结合转录因子携带自身NLS，如NF-κB基序RKKRRQRR。NF-κB p50结合质粒增强胞质迁移和核进入，报告增强约31倍。呈现方式比内在信号强度更重要，DNA结合转录因子可参与dynein运输。此类别是通往DTS的概念桥梁：DTS将转录因子识别序列编码于质粒，使核靶向成为DNA构建体的内在特性。
3. DNA nuclear targeting sequences (DTS) and transcription factor–mediated nuclear import of plasmid DNA
3.1 General mechanism of DNA nuclear targeting sequences
DTS是顺式作用DNA基序，在胞质募集携带NLS的转录因子，通过importin-α/β和Ran-GTP依赖搭便车入核。含特定增强子/启动子的质粒在非分裂细胞核积累，缺失者滞留胞质。入核可被WGA阻断，需要胞质importin-α、importin-β和Ran。DTS优势在分裂细胞中因核膜解体而消失。
3.2 SV40 enhancer (Universal DTS)
SV40增强子约72 bp，含NF-κB、AP-1、AP-2、Oct-1、TEF-1等结合位点，广泛细胞类型有活性。大鼠血管平滑肌中，含SV40增强子质粒报告表达2天约10倍、3天>40倍增加，原位杂交确认核积累增加。
3.3 NF-κB binding sequence DTS
NF-κB基序通常为GGGACTTTCC重复。静息细胞中IκBα掩盖NLS；TNF-α或IL-1β刺激后IκBα磷酸化降解，NF-κB入核。含NF-κB位点质粒核进入和报告表达约12倍增加；多串联位点增强，FRET显示核质粒积累高达60倍。3NF优化模块在体外和体内可提供增益，但依赖转染设置和NF-κB通路活性。
3.4 CRE (cAMP response element)–based DTS and microtubule-coupled trafficking
CRE基序由CREB识别，除核靶向还介导胞质定向运输。含CRE质粒与微管结合，经dynein向微管组织中心移动，缺乏CRE者仅随机布朗扩散。DTS可改善胞质运输和核输入两个连续步骤。
3.5 Tissue-specific DTS elements: SMGA, SP-C and T1α promoters
SMGA启动子含CArG盒和Nkx3.1/Nkx3.2位点，质粒在平滑肌细胞核积累，不在成纤维或内皮细胞；突变消除。SP-C启动子结合TTF-1和GATA-6，在小鼠肺报告阳性肺泡细胞约3倍增加。T1α启动子含HNF3/Foxa和TTF-1位点，破坏任一消除核转运。组织特异性DTS将选择性置于核输入层面，但牺牲绝对效率。
3.6 Comparative summary of DTS classes
DTS共同原则是序列特异性募集携带NLS的转录因子。SV40广泛活性，NF-κB刺激响应且可优化，CRE偶联胞质运输和核输入，SMGA、SP-C、T1α谱系限制。非分裂细胞中可提高核质粒积累和表达一个数量级以上，但受转录因子可用性、胞质质粒存活和载体解包暴露结合位点限制。
4. Chemical and structural coupling strategies
4.1 Electrostatic mixing/ionic binding
静电混合简单，但肽数量和位置不可控，复合物可能解离，高阳离子肽改变DNA凝聚和稳定性。表达增强可能源于核输入或DNA保护/胞内稳定性，需直接测量核DNA积累。
4.2 Covalent conjugation
共价偶联更稳定且可控制结构，但早期结果不一致。偶联位点和肽可及性是重要决定因素。DNA-PepTAG可独立改变NLS身份、连接长度和肽数，在生长停滞细胞中优化构型增加核定位和表达，某些构型效果差。
4.3 Bridging strategy (streptavidin–biotin)
生物素-链霉亲和素桥接可招募importin-β融合蛋白，增加核定位和报告表达。但蛋白适配体大，增加复合物尺寸、免疫原性和制造问题，许多概念验证依赖显微注射。
4.4 DNA peptide clamp
PNA钳或三链模块非共价结合DNA，呈现NLS。PNA-NLS钳在透化细胞增强核输入，招募importin-α/β。但高亲和三链形成需同嘌呤富集靶点，PNA合成昂贵，bulky钳可能妨碍解包或转录因子结合。
5. Nanoassembly platforms and structural determinants of nuclear delivery
5.1 Peptide-based nanoassemblies
5.1.1 Peptiplexes
阳离子肽与DNA静电组装，N/P比主导，高N/P减小粒径提高表面电荷，但降低NLS和DTS可及性。高级肽系统整合靶向配体、CPP、NLS和内体逃逸基序。hnRNP A1 M9与ScT构建体在融合内皮中83%转染和63倍表达增加，但核靶向标签可能混杂内体逃逸等。
5.1.2 Peptidic micelles
两亲肽自组装成胶束，可包裹核酸，具多区室和刺激响应。KRKR NLS加至两亲肽形成NLS功能化多室胶束，核进入经karyopherin识别，抗BCL2反义寡核苷酸达86%敲低。RALA肽压缩pDNA至<100 nm，酸性pH获得α螺旋驱动内体破坏。
5.1.3 Pros/cons and application of peptide carrier
肽载体可工程化，但稳定性和生产一致性受限，混合肽-脂系统常用。对DTS质粒，强凝聚延长胞质停留但过度凝聚遮蔽DTS。
5.2 Polymer-based nanoassemblies
5.2.1 Polyplexes: electrostatic assembly and cell-cycle dependence
阳离子聚合物如PEI、PLL、壳聚糖静电压缩DNA，PEI有质子海绵效应（H
+/H
2O内流）。核递送依赖有丝分裂被动进入，分裂细胞效率高，生长停滞细胞边缘。修饰NLS或病毒μ肽可增强非分裂细胞入核。壳聚糖整合IGFBP-3 NLS约2倍增加，IGFBP-5无效。应报告粒径、zeta电位和N/P比。
5.2.2 Polymeric micelles and polymersomes: structural engineering for programmed transport
胶束和聚合囊泡胶体稳定，corona可空间展示靶向配体，多价相互作用。组蛋白模拟H3尾部经importin-4促进染色质沉积和持续表达。携带双片段核质蛋白NLS的聚合囊泡经硫醇-烯点击化学连接，karyopherins识别、结合并护送通过NPC，Ran-GTP释放，电镜观察载体在孔内和核内。pH或氧化还原敏感连接可调解释放。
5.3 Lipid-based nanoassemblies
脂质载体包括脂质复合物、脂质纳米颗粒（LNP）、固体脂质纳米颗粒（SLN），摄取高效但内体滞留和胞质释放限制。NLS核靶向仅在DNA以可输入形式释放时有效。PEG–三吖啶嵌入剂带短NLS肽在难以转染的BBB内皮细胞中，脂质复合物表达提高15–16倍，聚合复合物10–11倍。地塞米松偶联SLN利用受体-配体复合物核转位。FLNP结合聚合物稳定和脂质摄取/逃逸，共递送HGF和CAT基因用于缺血疾病。TFAM纳米颗粒与VRK1共递送降低BAF聚集却降低报告表达。增加游离胞质DNA不足够，载体优化和核靶向应联合评估。
6. Experimental methods for evaluating nuclear delivery
核/胞质分级后qPCR提供核DNA积累的直接生化读出。荧光成像包括FISH、FRET和共聚焦，区分核膜结合与真正核内定位。报告基因测定如荧光素酶或GFP是功能读出但间接。模块组合变化可在匹配条件下比较候选基序，在生长停滞细胞中配对测量核定位和报告表达。建议至少结合一种直接核DNA积累测量和一种功能读出，以防将表达增强过度解释为核转运。
7. Comparative analysis: NLS vs DTS
7.1 Mechanistic and engineering differences
NLS直接募集importin受体，DTS利用DNA结合转录因子的内源NLS搭便车。NLS效率主要受载体内肽可及性支配，DTS效率主要受靶细胞转录因子可用性支配。NLS需肽合成和偶联方法，引入化学计量、连接长度、偶联位点、肽取向和制造一致性变量。DTS无需额外肽，靶向元件插入质粒序列，制造时复制，简单且质量控制优势，但设计模块性较低，功能依赖靶细胞生物状态。
7.2 Cell-type specificity and its limits
DTS优势是细胞类型或刺激依赖性特异性。组织特异性DTS如SMGA、SP-C、T1α在核输入层面赋予选择性。诱导型DTS如NF-κB在炎症或免疫激活时激活。但DTS依赖转录因子可用性和激活状态，缺乏者或上游信号缺乏者DTS介导输入极小。细胞周期依赖仍是主要约束。NLS内在细胞类型特异性较低，因为importin广泛表达，优势是通用适用性，但增加NLS本身不限制谱系，除非结合细胞特异性启动子、受体靶向载体或组织限制DTS。
8. Clinical translation and regulatory landscape
8.1 FDA approval status and regulatory considerations
截至2026年8月10日，FDA批准细胞和基因治疗产品列表未包括基于直接给药质粒DNA用于治疗性基因表达的非病毒治疗产品。FDA pDNA疫苗指南强调临床前测试、产品表征和制造。pDNA表达依赖组织分布、细胞摄取、内体逃逸、胞质存活、核进入和转录能力。NLS/DTS机制仍多为临床前优化策略。临床pDNA项目偏好可程序标准化的干预，如注射途径、电穿孔参数、剂量方案、受体靶向和局部暴露。Detalimogene voraplasmid为膀胱内非病毒产品，基于寡壳聚糖递送平台，针对高危BCG无应答NMIBC伴原位癌，获FDA加速开发资格，申办者计划2026年下半年启动BLA申报；若获批将建立直接给药治疗性pDNA监管先例，但其声明机制依赖局部膀胱内暴露、载体化学和转基因设计，而非明确NLS/DTS核输入模块。
8.2 Tavokinogene telseplasmid (IL-12 pDNA) + electroporation
TAVO-EP为瘤内注射IL-12编码质粒DNA后电穿孔，暂增质膜通透性。临床协议规定脉冲持续时间、电场强度和电极配置。黑色素瘤研究中产生局部和全身免疫效应。KEYNOTE-695与pembrolizumab联用，确认客观缓解率10.2%，低于预设阈值。应解释为物理pDNA递送平台而非主动NLS/DTS策略。
8.3 SGT-53 (TP53 pDNA targeted immunoliposome)
SGT-53为系统给药pDNA纳米复合物，野生型TP53质粒包裹于阳离子脂质体，抗转铁蛋白受体单链抗体片段修饰。I期在转移肿瘤组织检测到外源p53 DNA，正常皮肤未检测到。其设计强调肿瘤靶向和细胞摄取，而非NLS/DTS核进入。NCT02340117评估SGT-53联合吉西他滨/白蛋白紫杉醇治疗转移性胰腺癌。
8.4 Engensis (VM202; HGF pDNA intramuscular administration)
VM202非病毒质粒表达两种HGF亚型，肌内注射治疗痛性糖尿病周围神经病。无明确NLS/DTS机制，依赖局部给药、重复给药和瞬时HGF表达。III期主要终点未达，扩展队列显示疼痛减轻。提示改善核进入可能必要但不充分。
8.5 NV1FGF (FGF-1 pDNA; CLI)
NV1FGF为FGF-1表达质粒，治疗critical limb ischemia，重复肌内注射，无明确NLS/DTS。III期TAMARIS显示一年主要截肢或死亡无显著减少，未达疗效目标。即使核表达发生，单基因pDNA策略在复杂慢性疾病中可能不足。
8.6 Allovectin-7 (HLA-B7/β
2m pDNA-lipid complex)
Allovectin-7为HLA-B7和β
2-微球蛋白质粒与阳离子脂质复合，瘤内注射。II期ORR 9.1%和11.8%，低毒性。III期未达主要和次要终点，项目终止。需注意只在公司通讯报告，未经同行评审，无试验注册结果数据。代表脂质复合瘤内pDNA免疫基因治疗而非主动核靶向。
8.7 BC-819 (H19-DTA pDNA; intravesical administration)
BC-819为膀胱内pDNA，H19调控序列驱动白喉毒素A在H19表达恶性膀胱细胞选择性表达。非NLS/DTS核输入策略，而是肿瘤相关转录调控。I/II期标记病变研究，IIb期约三分之二患者预防新肿瘤生长，约三分之一标记病变消融。后续BCG无应答NMIBC II期因缺乏疗效终止。表明H19调控毒素表达可在特定NMIBC产生局部抗肿瘤活性，但不能克服上游递送和疗效屏障。
8.8 Why NLS/DTS mechanisms are rarely central in clinical pDNA products
NLS/DTS效应高度依赖环境：细胞周期、载体解包、胞质DNA存活、转录因子可用性和信号状态。人体组织和肿瘤异质，使受控模型中的核靶向效应难以临床重现。临床开发偏好可控程序变量：电穿孔、转铁蛋白受体靶向、局部肌内给药和重复给药更易标准化。添加NLS肽或复杂偶联化学增加制造和监管复杂性；DTS制造简单但性能与生物背景相关。临床失败表明仅表达增益不足。NLS/DTS科学上有吸引力但临床验证不足。
9. The nuclear accessibility index (NAI): an integrated design framework
9.1 Rationale and conceptual basis
尚无整合框架预测给定实验或治疗背景下核靶向策略是否有效。NAI为三轴评分框架，整合细胞分裂状态、载体-DNA可及性和细胞内信号背景。每轴三分，保留为有序向量，总和仅作次要描述。
9.2 Axis I—cell division status
分裂细胞有丝分裂核膜解体提供被动进入，转染在G
2/M较G
1高50–3000倍，独立于核靶向。分裂后或深度静息细胞核膜完整，依赖主动NPC运输。DTS主动输入增量优势在增殖群体中显著降低。评分：活跃分裂=1，可逆静息=2，终末分化/分裂后=3。
9.3 Axis II—carrier–DNA accessibility
NLS和DTS共同前提是质粒以可被输入机制利用的形式存在于胞质。NLS需可被importin-α/β接触，过度凝聚可遮蔽；DTS需转录因子可接触。保护不足则DNase II降解。评分：过度凝聚=1，保护不足/过早解离=2，优化=3。
9.4 Axis III—intracellular signalling context
经典NLS需胞质importin-α、importin-β、Ran-GTP和功能NPC。DTS关键为转录因子可用性。通用DTS广泛表达因子，诱导型DTS依赖信号，组织特异性DTS仅相关谱系。评分：经典途径组成活跃且普遍TF=3，诱导型需激活=2，组织特异性TF=1。
9.5 From axis scores to an axis vector: composite score, regions and strategy assignment
总和3–9，但加和有损，轴不可互换和相加。以向量NAI=(Axis I, Axis II, Axis III)为主。举例复合分7可为(1,3,3)、(3,3,1)、(2,2,3)，推荐不同。轴类型不同：Axis I不可控生物前提，Axis II可工程解决，Axis III主要决定特异性。三个示例：分裂后神经元最优聚复合物组成性importin=(3,3,3) composite 9 permissive；生长停滞上皮LNP内体逃逸不完全=(2,1,3) composite 6 carrier-limited；增殖癌细胞最优脂质复合物=(1,3,3) composite 7 excluded。
9.6 Permissive, conditional and excluded regions of NAI space
设计空间3×3×3分五区，按Axis I、II、III优先级评估。Excluded (Axis I=1)：增殖群体，主动核靶向增量小，投资应转向摄取、内体逃逸、胞质稳定和剂量。Carrier-limited (Axis II=1, Axis I≥2)：核膜屏障真实但质粒不可输入，需先改载体再评分。Specificity-dominated (Axis III=1, Axis I≥2, Axis II≥2)：仅谱系限制TF，组织特异性DTS限制表达，效率换选择性。Intermediate (Axis II=2, Axis I≥2, Axis III≥2)：质粒可及但胞质半衰期短，窗口窄，宜单一策略，先提高核酸酶保护。Permissive (Axis I≥2, Axis II=3, Axis III≥2)：两机制完全可操作且可加和，组合NLS+DTS预期最大受益。框架可证伪：NLS/DTS增益应在permissive大，excluded近零，carrier-limited纠正Axis II后可恢复。
9.7 Limitations and future directions
NAI为概念性而非定量，三点序数尺度提供战略指导，区域界限为可检验假设。可纳入微管运输、内体逃逸、胞质DNA半衰期、蛋白介导胞质DNA隔离；Axis III可分解为importin亚型、Ran-GTP梯度和TF激活状态；未表示细胞间异质性；NPC直径动态和静电选择性可能使复合物尺寸和表面电荷成为第四轴。NAI连接机制与转化问题：电穿孔、受体介导内吞和局部高剂量均提高Axis II而不影响Axis I或III，适用于carrier-limited区域，但不适用于分裂后组织限制靶点。平行读取核定位和表达的筛选平台可用于经验校准。
10. Conclusion
pDNA核递送仍是非病毒基因治疗基本瓶颈，尤其分裂后和静息细胞。NLS肽招募importin-α/β；DTS募集内源携带NLS转录因子，在非分裂细胞最强并可赋予细胞类型特异性。二者依赖载体，过度凝聚遮蔽信号，保护不足则降解。尽管机制证据，未纳入批准非病毒产品核心机制。临床项目依赖电穿孔、受体介导内吞和局部高剂量，提高胞质DNA可用性但不直接参与输入机制。NAI整合细胞分裂状态、载体-DNA可及性和信号背景，以轴向量分区。实现NLS/DTS治疗潜力需与保证胞质可及性的载体共设计、平行读取核定位和表达的筛选平台，并在分裂后组织限制背景验证。
