多组学整合揭示 Liaodan Black（LDM）与 Xinjin（XJM）猪的猪肉品质差异相关分子特征

《Foods》：Multi-Omics Integration Reveals Molecular Signatures Associated with Pork Quality Differences Between Liaodan Black and Xinjin Pigs

　　

这项探索性研究利用肉品质、脂肪酸和总氨基酸测定，结合对胸腰段最长肌（longissimus thoracis et lumborum muscle，LTL）的转录组学、蛋白质组学和未靶向代谢组学分析（所有分析每组 n = 3），研究了来自中国东北的两个地方猪种——Liaodan Black（LDM）和 Xinjin（XJM）之间的肉品质差异及相关分子特征。XJM 猪具有更高的肌内脂肪（intramuscular fat，IMF）含量和更低的剪切力，而 LDM 猪具有更高的烹饪产量。多重检验校正后，XJM 猪具有更高的油酸含量。总氨基酸分析显示，XJM 猪的丝氨酸、精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸含量更高，而 LDM 猪的异亮氨酸和亮氨酸含量更高。转录组学和蛋白质组学分析分别鉴定出 5678 个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）和 533 个差异丰度蛋白（differentially abundant proteins，DAPs），而未靶向代谢组学分析基于推定注释揭示了 622 个差异代谢物。这些分子差异主要与细胞骨架组织、氧化磷酸化、蛋白质周转、氨基酸代谢和中心碳代谢相关。转录组–蛋白质组整合鉴定出 258 个共享差异特征，其中 139 个在 mRNA 和蛋白质水平上显示一致变化。整合分析鉴定出九个候选分子。在 Benjamini–Hochberg 校正后，探索性相关分析显示 GOT1 和 GLO1 蛋白丰度与剪切力和烹饪产量负相关，而 ESD 蛋白丰度与 IMF 含量正相关。对选定 DEGs 的 qPCR 分析显示与 RNA-seq 结果具有良好一致性（r = 0.883，p < 0.001）。总体而言，所采样的 LDM 和 XJM 组之间观察到的差异主要与脂质沉积、肌肉结构相关过程和能量代谢相关。

猪肉品质是涉及嫩度、保水性、肉色、pH、肌内脂肪（intramuscular fat，IMF）以及脂肪酸和氨基酸组成等营养特征的复杂表型。遗传背景和育种目标可影响肌肉生长、脂肪沉积和营养代谢，形成品种特异肉品质。Liaodan Black（LDM）由辽宁黑母猪与 Duroc 父本杂交、回交和选育而来，2021 年获国家品种审定；Xinjin（XJM）起源于原新金和金县，被列为国家畜禽遗传资源库培育品种，体型结实，黑毛具白斑，适应区域生产条件。肉品质形成涉及基因转录、蛋白丰度和代谢小分子等多层协调变化。既往转录组、蛋白组和代谢组已用于猪肉品质研究，但多集中于地方猪与商业瘦肉型猪比较或 IMF、风味等单一性状，整合常规肉品质、脂肪酸、总氨基酸以及转录组、蛋白组和代谢组数据的研究仍有限。因此，研究人员在相同饲养管理下比较 LDM 与 XJM 的胸腰段最长肌（longissimus thoracis et lumborum，LTL）肉品质、脂肪酸和总氨基酸组成，并整合多组学识别相关分子特征。研究得出，XJM 组 IMF 和油酸较高、剪切力较低，LDM 组烹饪产量较高；差异主要与脂质沉积、肌肉结构相关过程和能量代谢相关。该研究从农业到食品角度提供了连接区域猪遗传资源与可测量猪肉品质结果的多组学线索，并给出需在更大独立队列验证的候选分子假设。

关键技术方法：样本来自中国辽宁省昌图黑猪育种场。LDM 和 XJM 母猪在相同饲养管理下饲养，每品种一个圈、每圈 20 头；6 月龄时每品种随机选 3 头屠宰，采集 LTL 肌肉，n = 3。测定 IMF、Warner-Bratzler 剪切力（WBSF）、烹饪产量、肉色和 pH_45min；用气相色谱-火焰离子化检测（GC-FID）测脂肪酸，用高效液相色谱（HPLC）测总氨基酸。转录组用 Illumina NovaSeq 6000 测序，HISAT2 比对，DESeq2 差异分析，并用定量 PCR（qPCR）验证。蛋白质组用数据非依赖采集（DIA）液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和 DIA-NN 定量。代谢组用 UHPLC-Orbitrap Exploris 120 正负离子模式、XCMS 处理及数据库推定注释。整合分析按基因符号匹配，结合 Rhea 酶-代谢物关联、Spearman 相关和 Mantel 检验。

研究结果：
3.1 LTL 肌肉肉品质特征：研究人员测量 LDM 与 XJM 的 LTL 肌肉。XJM 组 IMF 显著高于 LDM，剪切力显著低于 LDM；肉色 L*、a*、b* 无显著差异；XJM 烹饪产量显著低于 LDM；pH_45min 无显著差异。结论为 XJM 高 IMF、低剪切力，LDM 高烹饪产量。
3.2 脂肪酸和总氨基酸组成：GC-FID 和 HPLC 分析显示，多重检验校正后仅油酸（C18:1n-9c）在 XJM 中显著高于 LDM（adjusted p = 0.037；Hedges’ g = ?4.65，95% CI：?7.98 至 ?1.31）。C20:1、C18:2n-6 和 C20:3n-3 名义 p < 0.05，但校正后 adjusted p = 0.152，不显著。总氨基酸经 Benjamini–Hochberg（BH）校正后，XJM 的丝氨酸、精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸较高，LDM 的异亮氨酸和亮氨酸较高；甘氨酸名义 p = 0.031，校正后 adjusted p = 0.066，不显著。其余氨基酸校正后无显著差异。
3.3 转录组分析：RNA-seq 质量高，Q30 为 94.13–95.34%，总比对率 95.99–96.93%，唯一比对率 92.13–93.47%。主成分分析（PCA）显示 LDM 与 XJM 分离，层次聚类显示 DEGs 表达模式不同。火山图鉴定 5678 个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），包括 2899 个上调和 2779 个下调。基因本体（GO）富集涉及有丝分裂细胞周期 G1/S 转换、细胞周期检查点信号、姐妹染色单体分离、自噬体组装、DNA 损伤检查点等生物学过程；细胞组分涉及泛素连接酶复合体、高尔基膜、组蛋白乙酰转移酶复合体、组蛋白去乙酰化酶复合体、SAGA 复合体；分子功能涉及 tRNA 结合、SNARE 结合、微丝马达活性和脂肪酰辅酶A结合。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集包括 Proteasome、Ribosome、Cytoskeleton in muscle cells、Oxidative phosphorylation 和 Autophagy–animal。
qPCR 与 RNA-Seq 一致性分析：选取 10 个 DEGs 进行 qPCR。COL3A1、COL1A1、DES、TNNT3、MYH7 在 LDM 中表达较高，MYH4、NEB、TMOD4、MYL1、THBS2 在 LDM 中表达较低，与 RNA-seq 一致。两种方法 log₂FC 的 Pearson 相关 r = 0.883，p < 0.001，显示一致性良好。
3.4 蛋白质组分析：PCA 显示两组分离。共鉴定并定量 2067 个蛋白，533 个差异丰度蛋白（differentially abundant proteins，DAPs），其中 LDM 较 XJM 有 218 个丰度较高、315 个丰度较低。KEGG 富集包括 Oxidative phosphorylation、Ribosome、Proteasome 和 Pyruvate metabolism。GO 富集包括线粒体呼吸链复合体 I 组装、NADH 到泛醌的线粒体电子传递、翻译和 NADH 脱氢酶活性。
3.5 代谢组分析：正负离子模式 PCA 均显示分离；正离子 PC1、PC2 分别解释 44.7% 和 14.7%，负离子分别为 41.4% 和 16.6%。基于 OPLS-DA 的 VIP 值筛选，共推定注释 1844 个代谢物，622 个差异代谢物，其中 337 个在 LDM 中较 XJM 高、285 个较低。KEGG 富集包括 Aminoacyl-tRNA biosynthesis、Histidine metabolism 以及 Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis。
3.6 多组学整合分析：DEGs 与 DAPs 按基因符号匹配，得到 258 个共享差异特征，其中 139 个在 mRNA 和蛋白水平一致变化，包括 56 个一致上调和 83 个一致下调。139 个特征的转录和蛋白 log₂FC 线性回归 R² = 0.63。结合 Rhea 数据库酶注释和差异代谢物，筛选出九个候选：TALDO1、ALDH4A1、ESD、GLO1、UGP2、GOT1、MAOB、MDH1、NARS1。基因-代谢物和蛋白-代谢物热图模式相似：TALDO1 与 D-erythrose 4-phosphate 正相关、与 sedoheptulose 7-phosphate 负相关；GLO1 与 glutathione 正相关；GOT1 和 MDH1 与 L-glutamic acid、L-malic acid 负相关；ALDH4A1 与后两者正相关。Mantel 检验显示候选蛋白谱与 IMF 相关，差异代谢物谱与烹饪产量和剪切力相关，候选基因谱与肉品质未达 p < 0.05。BH 校正后相关网络保留 40 个 |Spearman’s ρ| ≥ 0.8 且 adjusted p < 0.05 的关联：GOT1 和 GLO1 蛋白丰度与剪切力和烹饪产量负相关，MDH1 蛋白丰度与烹饪产量负相关，ESD 蛋白丰度与 IMF 正相关；sedoheptulose 7-phosphate 与 IMF 负相关，L-malic acid 与烹饪产量正相关。

讨论部分总结：讨论指出肌肉结构和 IMF 沉积影响嫩度和食用品质。XJM 低剪切力与高 IMF 一致，但其烹饪产量低于 LDM，与 Choi et al. 报道的 Duroc 与 LYD 比较结果不同。IMF 贡献还取决于脂肪酸组成；本研究中 XJM 油酸较高，但未评价感官后果。氨基酸方面，XJM 的甲硫氨酸和苯丙氨酸较高，LDM 的亮氨酸和异亮氨酸较高；未测消化率，不能建立蛋白营养优劣。转录组显示肌肉结构组织和细胞外基质相关过程，COL1A1 和 COL1A2 在 LDM 中较高，与 LDM 高剪切力一致，但未测胶原含量、溶解度、交联和组织学，需验证。转录组和蛋白质组均富集氧化磷酸化；Complex I 相关 NDUFV1、NDUFV2、NDUFS8、NDUFS6、NDUFS5、NDUFC2、NDUFA2 及部分 NDUFB 家族成员在 LDM 中低于 XJM，提示线粒体蛋白组成和能量代谢差异，但未测 Complex I 活性、线粒体呼吸和死后 ATP 动态。蛋白质组 KEGG 还富集 Ribosome、Proteasome 和 Pyruvate metabolism；核糖体与肌肉生长和纤维表型相关，泛素-蛋白酶体系统与蛋白周转、死后肌原纤维降解和嫩度相关，丙酮酸代谢与死后 pH 下降相关，但 pH_45min 无差异，烹饪产量差异不能归因于早期 pH。代谢组主要关联氨基酸代谢和中心碳代谢；LDM 中 L-arginine、L-proline、L-glutamic acid 相对丰度较高，与酸水解氨基酸组成方向不同，但两者反映不同层面，不矛盾。精氨酸参与一氧化氮合成、尿素循环和多胺代谢，脯氨酸及羟脯氨酸是胶原重要成分，与结缔组织代谢相关。多组学整合中，53.9% 共享差异特征在 mRNA 和蛋白水平方向一致，说明转录变化不总预测蛋白差异。GOT1 与 MDH1 关联提示氨基酸利用和肌肉代谢特征的联系；Yang et al. 的小鼠 3T3-L1 实验为 GOT1 代谢作用提供功能背景。TALDO1 关联糖磷酸中间体。Welzenbach et al. 在 Duroc × Pietrain 猪中发现糖酵解和戊糖磷酸途径代谢物与死后 pH 和肉色关联。局限包括每品种 3 头、系谱未知、圈舍未重复、品种与圈舍效应混杂、同一 6 头猪用于三组学且 qPCR 同源样本、相关网络基于同批动物，因此结果应解释为采样组间探索性差异，需大样本独立验证。

结论部分翻译：这项探索性研究表征了三头 LDM 和三头 XJM 猪的肉品质和分子差异。XJM 猪表现出更高的 IMF 和油酸含量以及更低的剪切力，而 LDM 猪具有更高的烹饪产量和更高的细胞外基质相关基因转录水平。多组学整合鉴定出与脂质沉积、细胞外基质相关过程、线粒体蛋白组成和中心碳代谢相关的候选分子特征。其中，在多重检验校正的探索性网络中，GOT1 和 GLO1 蛋白丰度与剪切力和烹饪产量负相关，TALDO1 转录和蛋白丰度与糖磷酸中间体相关。这些关联为进一步研究提供假设；其可重复性和与肉品质的相关性需要在更大、独立队列中评估。