基于细胞ELISA的高通量筛选平台：靶向亚型非依赖性α2,6-唾液酸受体的流感病毒吸附抑制剂发现

《International Journal of Molecular Sciences》：A Cell-Based ELISA for High-Throughput Screening of Inhibitors Blocking Influenza Virus Attachment to the Subtype-Independent α2,6-Sialic Acid Receptor

　　

摘要专业翻译 耐药性的持续上升凸显了开发新型抗流感策略的迫切需求。靶向血凝素（hemagglutinin，HA）与唾液酸受体之间的相互作用为广谱抗病毒策略提供了有前景的途径，然而，缺乏能以亚型非依赖性方式报告受体识别步骤的筛选模型，严重制约了该领域的发展。为此，研究人员建立了一种稳健的细胞ELISA高通量筛选（high-throughput screening，HTS）平台，该平台基于亚型非依赖性的受体识别步骤运行。该模型利用过表达ST6GAL1的MDCK细胞富集人型α2,6-唾液酸受体，并以辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶联的接骨木凝集素（Sambucus nigra agglutinin，SNA）作为受体识别步骤的功能性（而非结构性）替代探针，获得了高达0.78的Z'因子。鉴于SNA是一种凝集素而非HA，该检测方法本身无法区分HA特异性阻断与膜介导效应或杀病毒效应，因此，每个阳性命中化合物均需进行正交验证。通过对含2600个化合物的文库进行筛选，研究人员鉴定出两个命中化合物——金丝桃素（Hypericin）和原卟啉IX（protoporphyrin IX，PPIX），二者能有效阻断SNA与受体的识别，IC50值分别为18.39 ± 6.23 μM和9.77 ± 3.05 μM。以FITC偶联SNA进行的正交流式细胞术检测在完整细胞上以剂量依赖性方式重现了这一抑制作用（金丝桃素IC50 = 17.68 ± 9.54 μM，PPIX IC50 = 25.31 ± 19.47 μM），证实该抑制并非显色读出的假象。采用不同预孵育策略的血凝抑制（hemagglutination inhibition，HAI）实验表明，两种化合物均作用于病毒颗粒而非宿主受体。表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）和分子对接研究进一步表明，二者与HA蛋白存在直接、剂量依赖性但亲和力较低的结合。值得注意的是，细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）实验证实了二者对H1N1和H3N2亚型的强效抗病毒活性，其中PPIX对H3N2表现出异常强效的活性（EC50 = 0.50 ± 0.17 μM）。综上，这些数据将金丝桃素和PPIX鉴定为作用于病毒侧的吸附抑制剂，其具有弱HA结合能力和多模式抗病毒活性。由于未设置杀病毒对照或融合阻断对照，HA参与对二者整体抗病毒效应的相对贡献仍有待确定。总之，这一符合BSL-1要求的ELISA平台探测亚型非依赖性的受体识别步骤，为发现广谱流感进入抑制剂提供了高效工具，所鉴定的命中化合物也为进一步的结构优化提供了新颖的药理学骨架。

论文解读

一、研究背景与目的

季节性流感流行对全球医疗系统和社会经济造成了沉重负担，其影响远超直接医疗成本，还包括因病缺勤和生产力下降带来的间接损失。尽管疫苗广泛可及，但抗原漂移和抗原转变频繁损害免疫效果，需要每年重新配制疫苗，且并非总能与流行毒株完全匹配。与此同时，一线抗病毒药物如M2离子通道阻断剂和神经氨酸酶抑制剂正面临耐药病毒株快速出现的严峻挑战。这种不断升级的耐药性凸显了开发靶向保守病毒组分、具有更高耐药遗传屏障的新型抗病毒药物的迫切需求。

病毒血凝素（hemagglutinin，HA）与宿主唾液酸受体的初始相互作用是病毒生命周期的关键瓶颈，是病毒进入和随后传播的门户。从药理学上干扰HA-受体结合具有双重益处：小分子抑制剂可结合HA受体结合位点从而阻断HA-受体相互作用，阻止病毒吸附到新宿主细胞；HA相互作用抗体则可破坏HA三聚体，限制子代病毒在培养物中的细胞间传播。然而，由于不同亚型（如H1、H3、H5）间HA球状头部结构域的高度变异性，开发靶向该步骤的广谱抑制剂历来困难重重。依赖特定HA亚型的传统筛选方法往往产生窄谱抑制剂，无法应对抗原变异威胁。因此，迫切需要一种绕过病毒变异性、聚焦保守宿主受体机制的筛选范式。

现有进入抑制剂鉴定方法存在操作和安全方面的明显缺陷。基于活病毒的检测虽具有生理相关性，但需要BSL-2/3高等级生物安全设施，资源密集且不适合高通量筛选（high-throughput screening，HTS）。假病毒系统虽降低了生物安全风险，但操作复杂且往往无法将受体结合事件与下游融合过程分离。此外，传统血凝抑制（hemagglutination inhibition，HAI）检测为半定量，易受主观判读影响，且缺乏筛选大型化合物文库所需的可扩展性。因此，亟需一种稳健、符合BSL-1要求、能报告亚型非依赖性受体识别步骤并可在高通量格式下定量评估HA-受体识别抑制作用的平台。

为规避病毒变异性障碍，研究人员提出假设：靶向保守的宿主受体——α2,6-连接唾液酸（人适应型流感病毒的主要结合位点）——可通过亚型非依赖性的受体识别步骤读出方式发现流感进入抑制剂。据此，研究人员开发了一种新型细胞ELISA高通量筛选平台，利用辣根过氧化物酶偶联的接骨木凝集素（HRP-SNA）作为多样且易变HA亚型的功能性替代探针，结合过表达ST6GAL1（α2,6-唾液酸转移酶）以富集表面受体的MDCK细胞，建立了标准化、比色法、符合BSL-1条件的检测体系，可直接通过OD₄₅₀读出定量测量化合物在病毒-宿主界面的干扰作用。

二、主要关键技术方法

研究人员构建了过表达ST6GAL1的MDCK细胞系（保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，编号CGMCC No. 46791），以富集人型α2,6-唾液酸受体。核心检测体系采用HRP偶联SNA作为HA的功能性替代探针，通过TMB底物显色在OD₄₅₀处定量读出受体识别步骤的抑制情况。验证体系包括：以重组H1N1（A/Puerto Rico/8/1934）和H3N2（A/Brisbane/10/2007）HA蛋白平行比较受体结合；以FITC偶联SNA进行流式细胞术正交验证；以完整流感病毒（H1N1 A/Puerto Rico/8/1934和H3N2 A/Aichi/2/1968）和豚鼠红细胞进行血凝抑制实验；以表面等离子体共振（SPR）检测化合物与HA蛋白的直接结合；以分子对接模拟预测结合模式；以细胞病变效应（CPE）抑制实验评估抗病毒效力。化合物文库为微生物天然产物和临床阶段抗感染化合物库（2600个化合物，DMSO储存液，来源于TargetMol和Selleck，由中国医学科学院医药生物技术研究所和北京协和医学院提供）。

三、研究结果

2.1 细胞ELISA筛选模型的建立与原理。 基于SNA特异性识别α2,6-连接唾液酸的原理，研究人员以HRP-SNA作为HA的功能性替代探针，在过表达ST6GAL1的MDCK细胞上建立了检测受体识别步骤的比色平台。抑制剂阻断SNA-受体相互作用会导致OD₄₅₀信号降低。

2.2 流感HA与SNA对同一受体的结合比较。 重组H1N1 HA、H3N2 HA和HRP-SNA均以浓度依赖性方式结合固定化MDCK-ST6GAL1单层细胞。以共同竞争剂6'-唾液酸乳糖（6'-SL）比较三种探针，其IC₅₀值分别为H1N1 HA 20.19 ± 7.88 μM、H3N2 HA 43.46 ± 23.30 μM和HRP-SNA 34.80 ± 4.09 μM，表明HA和SNA在相同细胞表面识别重叠的α2,6-唾液酸化受体群体，支持HRP-SNA作为HA功能性替代探针的合理性。

2.3 细胞ELISA筛选模型的优化。 系统优化关键参数后确定最终条件：HRP-SNA最佳浓度为1 μg/mL；采用4%多聚甲醛固定以确保生物安全；省略封闭步骤以简化流程；最佳孵育时间为60 min、温度为37 °C；DMSO浓度不超过2%时信号稳定。

2.4 模型稳健性评估。 阳性对照6'-SL在三个独立日期的浓度系列中合并IC₅₀为34.44 ± 2.39 μM，批间变异系数为6.95%。Z'因子测定为0.78，超过HTS标准阈值0.5，表明模型具有优异稳健性、低变异性和高重复性。

2.5 初步筛选与活性抑制剂鉴定。 以25 μM单一浓度筛选2600个化合物，4个化合物抑制率超过50%。二次筛选确认金丝桃素和PPIX呈清晰剂量依赖性抑制，IC₅₀分别为18.39 ± 6.23 μM和9.77 ± 3.05 μM。排除实验证实二者不抑制HRP酶活性；2 h短期细胞毒性评估排除了细胞脱落导致的假阳性；48 h CCK-8评估显示金丝桃素在25 μM时细胞活力低于50%，而PPIX在200 μM时细胞活力仍高于50%；固定与未固定单层细胞中抑制效果相当。

2.6 流式细胞术正交验证。 以FITC偶联SNA进行的流式检测中，金丝桃素和PPIX均以剂量依赖性方式抑制FITC-SNA与MDCK-ST6GAL1细胞的结合，IC₅₀分别为17.68 ± 9.54 μM和25.31 ± 19.47 μM，与ELISA结果一致。初筛阴性化合物几乎无抑制作用，阳性对照6'-SL重现剂量依赖性抑制。化合物自身荧光对照排除了信号干扰。

2.7 血凝抑制实验。 当化合物与流感病毒（HA）预孵育后再加入豚鼠红细胞时，金丝桃素和PPIX均有效抑制H1N1和H3N2亚型HA介导的血凝，且对H1N1的抑制活性强于H3N2。当化合物与红细胞预孵育后再加入病毒时，两种化合物均无抑制，表明其作用于病毒侧而非宿主受体。

2.8 SPR结合亲和力分析。 重组H1N1和H3N2 HA蛋白固定于传感芯片后，金丝桃素的K_D分别为7.89 × 10^?4 mol/L（H1N1）和9.44 × 10^?4 mol/L（H3N2），PPIX的K_D分别为4.58 × 10^?3 mol/L（H1N1）和8.37 × 10^?4 mol/L（H3N2）。二者均不显著结合BSA参考通道，证实与HA的结合具有特异性。

2.9 分子对接预测保守HA位点结合。 对接结果显示金丝桃素和PPIX均结合H1N1和H3N2 HA蛋白的结合位点，形成氢键、盐桥和疏水相互作用。S评分显示PPIX对两种HA蛋白的亲和力均强于金丝桃素。

2.10 CPE抑制实验。 对H1N1亚型，金丝桃素EC₅₀为1.96 ± 0.38 μM，PPIX为2.51 ± 0.44 μM；对H3N2亚型，金丝桃素EC₅₀为1.98 ± 0.22 μM，PPIX为0.50 ± 0.17 μM。PPIX对H3N2的效力约为对H1N1的四倍，呈亚型依赖性效力特征。

2.11 计算机ADMET预测与结构优化策略。 ADMET预测显示金丝桃素分子量高（504.08 Da）、脂溶性极强（LogP = 7.13）、水溶性极差（LogS = ?10.19），违反Lipinski五规则，预测存在药物性肝损伤（DILI概率0.984）、皮肤致敏和眼刺激风险。PPIX分子量为562.26 Da、LogP为6.79，违反Lipinski和GSK规则，肠道吸收极低（HIA概率0.012）、生物利用度差（F < 30% = 0.003）、血浆蛋白结合率极高（97.62%），预测存在高DILI（0.969）和呼吸毒性（0.974）风险。

四、讨论总结与研究结论

讨论部分指出，该平台的核心创新在于以HRP偶联SNA作为多种HA亚型的功能性替代探针。尽管SNA和HA属于不同蛋白家族，但二者均特异性识别α2,6-连接唾液酸，且通过共同的生物物理逻辑识别唾液酸——芳香族残基通过CH-π相互作用锚定非极性面，极性或带电残基通过氢键和盐桥锁定羧酸根、甘油羟基和乙酰氨基。这一受体结合框架及其核心残基在流感A亚型和B系中保守，使受体识别步骤成为可被单一替代探针靶向的亚型非依赖性弱点。研究同时明确指出平台的两个局限：未进行杀病毒或融合阻断实验，无法排除这两种贡献；缺乏公认的HA受体结合位点参考标准，平台灵敏度未经确定性校准，因此应视为推定筛选，每个命中化合物均需正交确认。基于ELISA、流式、HAI、SPR和CPE的多重一致证据，金丝桃素和PPIX被归类为具有弱HA结合能力和多模式抗病毒活性的病毒侧吸附抑制剂。ADMET分析揭示了两者的成药性挑战，将其定位为解析进入机制的药理学工具而非直接临床候选物，临床转化需要合理的结构优化。

研究结论为：该工作提供了一种针对亚型非依赖性受体识别步骤的实用筛选方法，消除了发现广谱进入抑制剂的一大长期障碍。SNA作为HA的功能性而非结构性替代物，足以使检测体系发现干扰保守结合事件的化合物。但读出跟踪的是受体识别而非HA结合本身，因此位点特异性阻断、膜介导损伤和杀病毒效应在此仍不可区分，独立确认是工作流程的组成部分而非可选项。基于现有证据，金丝桃素和PPIX应被视为具有弱HA结合能力和多模式抗病毒活性的病毒侧吸附抑制剂。