QSAR引导的哌嗪基邻氨基苯甲酰胺类Factor Xa抑制剂计算机辅助设计：适用域评估、ADMET分析、分子对接、分子动力学与MM/GBSA

《International Journal of Molecular Sciences》：QSAR-Guided In Silico Design of Piperazinylanthranilamide Factor Xa Inhibitors: Applicability-Domain Assessment, ADMET Profiling, Molecular Docking, Molecular Dynamics, and MM/GBSA

　　

研究人员开发了一个集成计算工作流，用于对哌嗪基邻氨基苯甲酰胺类因子Xa（Factor Xa，FXa）抑制剂候选物进行优先级排序。研究人员对20个文献化合物进行了几何优化，并使用alvaDesc描述符构建了约束加性多元自适应回归样条（MARSplines）模型。内部验证和适用域（applicability domain，AD）评估指导了对20个前瞻性类似物的评估。将10个选定类似物和2个同系列参照物与FXa进行对接，并以阿哌沙班为晶体学对照。对13个初始100 ns分子动力学（molecular dynamics，MD）模拟，研究人员又对PAX-M09、PAX-M15和PAX-M18各进行了两次独立运行。使用分子力学/广义Born表面积（MM/GBSA）方法评估结合能，同时进行计算机模拟可开发性分析。该模型实现了R²=0.904，内部留一法交叉验证Q²=0.846。PAX-M09是最强的严格域内预测，而PAX-M15处于边界。阿哌沙班重新对接的均方根偏差（RMSD）为0.953 ?。尽管PAX-M17和PAX-M19在对接中排名最高，后续分析优先考虑了PAX-M15、PAX-M09和PAX-M18。PAX-M15在重复模拟中表现出最一致的位置行为，并具有各次运行均有利的MM/GBSA估计值（?68.76、?70.11和?69.42 kcal/mol）。PAX-M09和PAX-M18则表现出更大的运行间异质性。溶解度、代谢和毒性问题仍然重要。这些结果支持对这三个候选物进行实验研究，但并未改变其适用域分类，也未确立其具有更优的实验效力。

血栓栓塞疾病是全球发病和死亡的重要原因，抗凝治疗是防治静脉和动脉血栓事件的核心。因子Xa（FXa）在凝血级联中催化凝血酶原激活，是直接抗凝策略的既定靶点，但现有FXa抑制剂仍面临出血、肾功能损害、药物相互作用等问题。邻氨基苯甲酰胺衍生物可组织S1/S4识别元件，其中Khadse et al.报道的哌嗪基邻氨基苯甲酰胺系列包含59个衍生物，其中20个经过半数抑制浓度（IC₅₀）测定，具有共同的骨架和P1/P4区域可控变化，适合描述符建模。由于数据集小，定量构效关系（QSAR）建模需约束复杂度，并结合交叉验证、Y随机化和适用域（AD）评估。本研究的目的是构建一个逐步计算优先排序工作流：用DFT优化几何、alvaDesc描述符、随机森林预选和约束加性多元自适应回归样条（MARSplines）建模，在适用域内设计20个类似物，再通过分子对接、分子动力学（MD）和MM/GBSA进行受体层面优先排序，并整合ADMET预测。研究人员最终确定了PAX-M09、PAX-M15和PAX-M18为最有前景的候选，但强调结果属于计算框架而非实验确认。

关键技术方法概括：训练集来自Khadse et al.报道的20个哌嗪基邻氨基苯甲酰胺衍生物（IC₅₀ 0.61–39.9 μM）。主要流程为：Gaussian 16在B3LYP/6-311++G(d,p)水平进行DFT优化和频率验证；alvaDesc生成5799个描述符，经常数过滤和随机森林预选至30个；采用限制不超过四个基函数的加性MARSplines建模；用杠杆h*与描述符范围判定适用域；设计并同法评估20个类似物（PAX-M01–PAX-M20）；用Glide XP对接至FXa（PDB ID 2P16）；用Desmond进行100 ns MD，对PAX-M09、PAX-M15、PAX-M18各加两次重复；用Prime MM/GBSA计算结合能；用SwissADME/BOILED-Egg和pkCSM预测ADMET。

研究结果如下：

2.1 活性分布与来源系列SAR：20个训练化合物pIC₅₀覆盖4.399–6.215，6y、7f、7v活性最高；来源SAR显示5-氯-2-噻吩基P1和对氟苯基哌嗪P4有利。

2.2 DFT优化与几何质量控制：所有20个化合物优化正常终止，零虚频，确认局部极小。

2.3 描述符约简与随机森林排序：5799个描述符经技术约简和近常数排除后剩1099个，随机森林Top-100经相关剪枝得到30个描述符矩阵。

2.4 回归算法比较：三描述符MLR的R²=0.668、Q²_LOO=0.533；PLS、岭回归、弹性网和SVR表现较弱；MARSplines显著改善。

2.5 最终约束加性MARSplines模型：采用三项基函数，涉及Mor21m、RDF055e和SHED_AL，显示阈值依赖关系。

2.6 内部验证与适用域：最终模型R²=0.904，Q²_LOO=0.846；200次重复五折平均Q²=0.830±0.041；1000次Y随机化未达到观测Q²；6y为高杠杆点，7m接近残差阈值。

2.7 模型引导的设计面板：设计20个类似物，为10对匹配的单甲氧基/二甲氧基P4取代对，保留5-氯-2-噻吩基P1。

2.8 前瞻性DFT优化与描述符计算：所有20个类似物均正常终止、零虚频。

2.9 前瞻性活性预测与适用域：7个严格域内，PAX-M15为边界，12个域外；PAX-M09为最强严格域内预测（pIC₅₀=6.001）。

2.10 对接面板选择：10个类似物进入受体阶段，包括7个严格域内、PAX-M15及PAX-M17/PAX-M08两个探索性域外候选。

2.11 计算机模拟ADMET和BOILED-Egg分析：SwissADME预测高GI吸收、无BBB渗透，但PAX系列亲脂性高、溶解度差；pkCSM预测吸收较好，但存在CYP抑制、hERG-II抑制和肝毒性等担忧；两平台在P-gp和CYP分类上存在分歧。

2.12 分子对接研究：阿哌沙班重对接RMSD为0.953 ?；PAX-M17和PAX-M19对接得分最高，但未对应最优动态/能量结果；并观察到Gly216/Gly218氢键和Trp215 π–π等接触。

2.13 分子动力学与MM/GBSA分析：

2.13.1 初始100 ns筛选：蛋白骨干RMSD较小，PAX-M15、PAX-M04、PAX-M09和PAX-M18保持较接近初始构象，PAX-M12出现晚期变化但接触保留。

2.13.2 选定PAX复合物的重现性：PAX-M15三次运行位置RMSD最一致（1.59±0.33、2.11±0.50、1.78±0.43 ?）；PAX-M09第二次运行出现不同构象（5.79±0.20 ?），PAX-M18运行间差异较大。

2.13.3 MM/GBSA端点估计：PAX-M15各次运行均最有利（?68.76、?70.11、?69.42 kcal/mol），PAX-M09和PAX-M18次之；对接最高分的PAX-M17和PAX-M19端点估计较差。

讨论部分指出，非线性阈值依赖关系对描述该系列FXa抑制很重要，但模型只是该化学系列的局部表征；Mor21m、RDF055e和SHED_AL是统计预测因子而非直接作用力。适用域评估显著影响候选选择，避免了将外推值当作定量预测。QSAR、对接、MD和MM/GBSA提供互补信息，顺序整合而非单一评分更有价值。PAX-M15的受体行为最一致，PAX-M09因严格域内而重要，PAX-M18提供不同动态特征。同时，高亲脂性、低溶解度、低游离分数和CYP抑制等可开发性问题提示不能只关注亲和力。局限性包括数据集小、单一DFT构象、类似物未合成、ADMET预测为模型依赖、模拟时间有限及MM/GBSA的近似性。

本研究结论可翻译为：这项研究展示了将约束QSAR模型与明确适用域评估和受体精细分析相结合进行前瞻性FXa抑制剂优先级排序的价值。集成工作流确定了PAX-M09、PAX-M15和PAX-M18为最值得进一步研究的候选物，同时表明基于配体的预测、对接、MD和MM/GBSA提供互补而非可互换的信息。结果应被视为计算优先排序框架，而非实验确认效力的证据。未来工作应聚焦于合成、生化FXa抑制和选择性测试、适当的直接结合表征以及实验ADME评价，尤其考虑到预测的溶解度和代谢缺陷。