《International Journal of Molecular Sciences》：Identification of Calcium-Sensing Receptor (CAS) as a Phytaspase Interactor: Implications for the CAS Trafficking Pathway
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蛋白水解酶在调控活细胞中的蛋白质稳态方面发挥着重要且多样的作用。植物胱天蛋白酶（Phytaspase）是植物枯草杆菌蛋白酶家族的一员，具有类似胱天蛋白酶的靶标水解选择性和特异性，是一种与细胞死亡相关的蛋白酶。Phytaspase表现出独特的转运模式，并参与由生
蛋白水解酶在调控活细胞中的蛋白质稳态方面发挥着重要且多样的作用。植物胱天蛋白酶（Phytaspase）是植物枯草杆菌蛋白酶家族的一员，具有类似胱天蛋白酶的靶标水解选择性和特异性，是一种与细胞死亡相关的蛋白酶。Phytaspase表现出独特的转运模式，并参与由生物和非生物胁迫诱导的植物细胞死亡的执行过程。为了阐明phytaspase发挥功能的分子机制，研究人员利用BioID方法筛选了烟草（Nicotiana tabacum）phytaspase（NtPhyt）的互作蛋白。该筛选鉴定出钙敏感受体（calcium-sensing receptor, CAS）蛋白作为候选的NtPhyt互作因子。通过体外纯化蛋白分析证实了NtPhyt与烟草CAS（NtCAS）的直接相互作用。此外，研究表明NtPhyt可在体外对CAS分子进行五次切割。在本氏烟（N. benthamiana）叶片中表达的NtCAS-EGFP被观察到定位于叶绿体和细胞周边（包括质膜），而NtPhyt的蛋白水解活性在叶绿体中未被检测到。研究发现，一种保留了叶绿体转运肽的CAS前体蛋白在光-暗转换后积累，并在NtPhyt水平升高时消失。研究揭示了CAS对于胁迫诱导的NtPhyt逆向运输的必要性，并观察到在氧化胁迫细胞中CAS与NtPhyt的部分共定位。本研究结果与以下模型一致：CAS在其最终目的地——叶绿体的运输途中，会短暂地定位于质膜作为一个中间站点，并在此阶段与NtPhyt发生相互作用。
研究背景与科学问题
在活细胞中，蛋白质的行为复杂多变，一些蛋白是典型的“居家者”，而另一些则需要长途跋涉才能到达其最终目的地，并随时准备根据外界信号改变自身定位。植物胱天蛋白酶（Phytaspase）是一类与细胞死亡相关的植物枯草杆菌蛋白酶家族成员，它们无疑属于后者。Phytaspase具有非凡的选择性和类似胱天蛋白酶的、针对天冬氨酸的特异性水解活性。它们最初以无活性的前体酶原形式合成，像大多数植物枯草杆菌蛋白酶一样，经由内质网和高尔基体分泌至质外体。在这一顺向运输过程中，phytaspase前体在植物细胞内经历组成型且自催化方式的加工而被激活，成熟酶最终释放到质外体。然而，当感知到生物或非生物的致死性刺激时，phytaspase会利用网格蛋白介导的内吞作用重新进入植物细胞，从而接近其胞内靶标。这种水溶性的胞外酶如何在胁迫诱导下通过网格蛋白介导的内吞作用实现“逆向运输”的机制尚不清楚，这促使研究人员寻找可能参与phytaspase胁迫诱导内化过程的互作蛋白。此前，已鉴定出两个烟草phytaspase的互作伴侣：可溶性内质网分子伴侣钙网蛋白3和与质膜磷脂结合的胞内Tubic蛋白。为进一步探索，本研究结合体内邻近依赖性生物素标记方法和体外纯化蛋白分析，鉴定了烟草钙敏感受体（NtCAS）作为NtPhyt的互作伙伴和底物。
拟南芥CAS最初被鉴定为介导胞外钙离子浓度增加引起胞质钙离子浓度升高的蛋白。CAS主要在包括保卫细胞在内的地上部分表达，其下调会破坏胞外钙离子信号传导。CAS还能同步植物胞质钙离子浓度与胞外钙离子浓度的昼夜节律振荡。在整体叶片水平，CAS反义植物在胞外钙离子诱导的三磷酸肌醇产生方面受损，从而可能将CAS功能与内部钙库的释放偶联起来。尽管早期研究认为AtCAS定位于质膜，但后续分析指出叶绿体类囊体膜才是CAS积累的场所。CAS是一个约40 kDa的蛋白，具有N端叶绿体转运肽和一个位于分子中间的跨膜结构域。蛋白的羧基末端半段显示出与非催化性硫氰酸酶同源结构域的序列相似性，可能参与蛋白-蛋白相互作用；而氨基末端半段则具有低亲和力/高容量的钙离子结合特性。因此，植物CAS在结构和定位上都与动物钙敏感受体显著不同。已有数据表明CAS在植物免疫信号中扮演重要角色，并且也参与了干旱等非生物胁迫响应。然而，CAS生物学功能（包括其在胞外钙离子感应、胁迫响应、植物免疫和细胞死亡中的作用）背后的分子机制在很大程度上仍是未知的。由于CAS与phytaspase的相互作用可能为这两种蛋白的功能提供新的线索，本研究致力于阐明这种相互作用发生的时间和地点。
主要技术方法
- 1.
体内邻近依赖性生物素标记结合液相色谱-串联质谱法：将TurboID生物素连接酶融合至NtPhyt的C端，在本氏烟叶片中瞬时表达，通过链霉亲和素磁珠富集生物素化蛋白并进行LC-MS/MS鉴定，筛选候选互作蛋白。
- 2.
体外结合与切割实验：在大肠杆菌中分别表达MBP融合的NtCAS的N端和C端结构域，固定于直链淀粉树脂上，与纯化的NtPhyt孵育，通过检测洗脱液中NtPhyt的蛋白酶活性评估结合，并通过SDS-PAGE和质谱分析确定切割位点。
- 3.
亚细胞定位分析：通过农杆菌介导的瞬时转化在本氏烟叶片中共表达荧光融合蛋白，利用共聚焦荧光显微镜观察蛋白的亚细胞分布，并通过分离完整叶绿体结合活性测定确认NtPhyt是否存在于叶绿体中。
- 4.
病毒诱导的基因沉默：利用烟草脆裂病毒载体构建靶向NbCAS的VIGS体系，沉默本氏烟中CAS的表达，评估其对INF1诱导的细胞死亡和NtPhyt胁迫诱导内化的影响。
研究结果
2.1 鉴定CAS为Phytaspase互作蛋白
研究人员利用TurboID介导的邻近标记结合LC-MS/MS分析，从NtPhyt-TurboID样品中富集并鉴定了多个候选互作蛋白，其中本氏烟的钙敏感受体（NbCAS）因超过10个胰蛋白酶肽段的可靠鉴定而被重点关注。随后，体外结合实验证实，纯化的NtPhyt能够与固定在直链淀粉树脂上的MBP_N-CAS和MBP_C-CAS两种融合蛋白结合，而与游离的MBP蛋白无显著结合，证明了两者的直接物理相互作用。
2.2 CAS是Phytaspase的底物
体外切割实验显示，NtPhyt处理导致MBP_N-CAS和MBP_C-CAS均发生片段化，而游离MBP保持完整。这种切割能被NtPhyt特异性抑制剂Ac-VEID-CHO抑制，但不受caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO影响，证实了切割的特异性。通过MALDI-TOF质谱分析，研究人员在C-CAS中鉴定出一个切割位点（D362），而在N-CAS中鉴定出四个切割位点（D99、D117、D140、D168）。将这四个天冬氨酸突变为谷氨酸后，突变体MBP_N-CAS-4D/E对NtPhyt的处理具有抗性，进一步验证了这些位点的功能性。值得注意的是，大多数这些切割位点在进化上相对保守。
2.3 NtCAS而非Phytaspase存在于完整叶绿体中
通过分离表达NtCAS-EGFP的本氏烟叶片完整叶绿体并进行荧光显微镜观察，确认了NtCAS确实定位于叶绿体。然而，使用Ac-VEID-AFC底物检测发现，在完整叶绿体裂解液中未检测到NtPhyt的蛋白水解活性，而可溶性蛋白组分中活性丰富。这表明NtPhyt不存在于叶绿体中，因此两者的相互作用可能发生在NtCAS抵达叶绿体之前。
2.4 NtCAS在本氏烟叶细胞中的双重定位
共聚焦显微镜观察显示，除了叶绿体定位外，NtCAS-mRFP还呈现出明显的细胞周边定位，并与质膜标记蛋白LTI6b-EGFP共定位。免疫印迹分析表明，完整的NtCAS-EGFP主要存在于不溶性蛋白组分中，与其含有跨膜结构域的特征相符。在非胁迫条件下，共表达的NtPhyt-mRFP和NtCAS-EGFP无明显共定位，但NtPhyt的过量表达似乎改变了CAS的定位模式。当使用抗霉素A诱导氧化胁迫后，NtPhyt发生逆向运输进入细胞，并与NtCAS在细胞边界附近的结构中出现部分共定位。
2.5 CAS前体蛋白——一个新角色
免疫印迹分析显示，NtCAS-EGFP除了主要的约60 kDa成熟蛋白条带外，还存在一条微弱的约70 kDa条带，该条带对应于尚未切除N端叶绿体转运肽的前体蛋白（preCAS-EGFP）。将植物置于黑暗环境中两天，会导致preCAS-EGFP条带显著增强，同时伴随着NtCAS-EGFP在细胞周边的定位增加。当与NtPhyt-mRFP共表达时，黑暗条件下积累的preCAS-EGFP条带完全消失，而成熟的60 kDa条带也略有减少。这表明NtPhyt的水平能够影响CAS的体内行为，并且preCAS（而非叶绿体定位的成熟CAS）可能是与NtPhyt相互作用的潜在形式。
2.6 CAS是胁迫诱导的Phytaspase内化所必需的
通过VIGS技术有效沉默了本氏烟中NbCAS的表达。与对照相比，CAS沉默植株中由疫霉菌INF1蛋白诱导的坏死反应被显著抑制，而过量表达CAS-EGFP则增强了坏死，这与CAS参与免疫反应的已知功能一致。重要的是，在非胁迫条件下，CAS沉默不影响内源性phytaspase的分泌和基础活性。然而，当用抗霉素A诱导氧化胁迫时，对照植株中NtPhyt-mRFP发生了典型的内化，形成靠近质膜的斑点状结构；但在CAS沉默植株中，即使经过抗霉素A处理，NtPhyt-mRFP仍然保持平滑的质外体定位，其内化过程被显著抑制。这一结果揭示了CAS对于胁迫诱导的NtPhyt逆向运输是不可或缺的。
讨论与结论
本研究揭示了一个出乎意料的联系：烟草phytaspase（一种主要定位于质外体的细胞死亡相关蛋白酶）与钙敏感受体CAS（一种介导胞外钙离子诱导胞质钙离子增加的介质）之间存在关联。尽管NtPhyt不存在于叶绿体，而NtCAS最终定位于叶绿体类囊体膜，但多项证据支持两者相互作用的可能性：体内BioID筛选、体外直接结合与切割、NtCAS的双重定位（叶绿体和细胞周边）、氧化胁迫下的部分共定位、CAS对NtPhyt内化的必要性以及黑暗条件下积累的preCAS对NtPhyt水平的敏感性。
综合这些观察，研究人员提出一个模型：CAS在前往其最终目的地叶绿体的途中，可能会短暂地定位于质膜作为一个中间站点。正是在这个位置，带有叶绿体转运肽的preCAS暴露于质外体，从而有机会与同样位于质外的NtPhyt相遇。黑暗条件可能阻碍了CAS向叶绿体的正常转运，导致preCAS在质膜处积累，使其更易受到NtPhyt的影响。NtPhyt对CAS的多位点切割（特别是N端的四个切割位点）在高度特异的phytaspase中并不常见，但其进化保守性暗示其具有重要功能。这可能是一种调节胞质钙离子平衡、参与植物细胞死亡程序以确保免疫应答的机制。
总之，本研究得出结论：CAS与phytaspase的相互作用很可能发生在CAS到达叶绿体之前，可能是在质膜上，这对理解CAS的转运途径具有重要意义。另一方面，研究还发现了CAS对于胁迫诱导的细胞死亡相关蛋白酶NtPhyt逆向运输的必要性，为理解植物细胞如何协调胞外信号、钙信号和细胞死亡程序提供了新的视角。
