《International Journal of Molecular Sciences》：Development and Genomic Validation of a Population-Specific SNP Panel for Parentage Verification in Chinese Holstein Cattle
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巨噬细胞通过释放调节骨祖细胞行为的生物活性因子，在骨再生中发挥重要作用。在这项体外研究中，研究人员考察了来自RAW 264.7巨噬细胞的条件培养基（CM）如何调节MC3T3-E1前成骨细胞的增殖和成骨分化；这些巨噬细胞分别经脂多糖（LPS；1或100 ng/m
巨噬细胞通过释放调节骨祖细胞行为的生物活性因子，在骨再生中发挥重要作用。在这项体外研究中，研究人员考察了来自RAW 264.7巨噬细胞的条件培养基（CM）如何调节MC3T3-E1前成骨细胞的增殖和成骨分化；这些巨噬细胞分别经脂多糖（LPS；1或100 ng/mL）、地塞米松（DEX；10?6 M）处理或未处理。通过显微镜形态学、硝基蓝四氮唑（NBT）还原以及巨噬细胞肿瘤坏死因子-α（TNF-α）分泌测定，LPS和DEX暴露产生了不同的巨噬细胞活化模式。在L929生物测定中，没有CM具有细胞毒性，而对MC3T3-E1增殖和分化的影响随巨噬细胞处理和CM稀释度变化。来自DEX处理巨噬细胞的CM引起最显著的成骨活性模式，包括细胞增殖降低、获得成骨细胞样形态、von Kossa染色增强以及骨钙素（OCN）和骨桥蛋白（OPN）免疫表达显著。来自未处理巨噬细胞的CM也支持成骨，但程度较低。在100%时，来自LPS处理巨噬细胞的CM比其他CM支持更强的前成骨细胞增殖，而它们对分化的影响取决于LPS剂量和CM稀释度。这些发现表明，巨噬细胞来源信号根据其功能状态差异性地调节前成骨细胞增殖和分化。该研究为骨组织工程中免疫调节和再生策略的发展以及伤口愈合更广泛应用提供了有价值的体外细胞模型。
研究背景与问题：骨再生与修复需要免疫细胞和骨骼细胞协调互作。巨噬细胞是骨生成的关键调节者，能够根据微环境采用不同功能状态。传统M1/M2分类是简化描述，因为生物系统中的巨噬细胞活化是异质功能状态的连续谱，而非两个离散表型。组织修复包括炎症、修复和重塑阶段。炎症阶段，细胞因子和生长因子招募免疫细胞和祖细胞；巨噬细胞产生促炎细胞因子、生长因子和活性氧（ROS），塑造早期愈合环境，参与碎片清除和间充质祖细胞招募，但持续或过度炎症可损害愈合。随后巨噬细胞可转向修复功能，分泌因子调节修复细胞增殖和分化，支持血管生成和细胞外基质（ECM）重塑。现有证据强调局部免疫环境，尤其巨噬细胞来源信号调控骨祖细胞行为。促炎巨噬细胞常与增强增殖和间充质干细胞初始招募相关，某些条件下也可增强成骨分化和基质矿化；抗炎和修复性巨噬细胞主要与成骨分化和ECM矿化相关。但不同巨噬细胞活化状态对成骨的具体影响仍不完全清楚，巨噬细胞可塑性使不同刺激及不同CM浓度结果难以比较。为此，研究人员在同一RAW 264.7–MC3T3-E1系统中，直接比较LPS两个浓度、DEX或未处理来源CM及其不同稀释度对MC3T3-E1早期反应的影响，采用CM转移的间接共培养模型，不涉及直接细胞接触或相互信号。研究结论为：CM无细胞毒性；巨噬细胞来源信号依功能状态差异调节前成骨细胞增殖与分化；M(GC)-CM表现出最显著成骨相关模式；100% M(LPS)-CM支持更强增殖；稀释效应因巨噬细胞状态而异。该研究为骨组织工程中免疫调节和再生策略以及伤口愈合研究提供了体外细胞模型。
关键技术方法：使用小鼠细胞系RAW 264.7巨噬细胞（ATCC）、L929成纤维细胞（ATCC）和MC3T3-E1前成骨细胞（DSMZ）。RAW 264.7分别经100 ng/mL或1 ng/mL LPS、10
?6 M DEX处理4 h，换新鲜DMEM后再培养20 h，收集CM；未处理组按相同换液和培养方案。用NBT还原评估巨噬细胞氧化活性，ELISA测CM中TNF-α，MTT检测CM对L929细胞毒性。用结晶紫（CV）染色评估MC3T3-E1贴壁细胞生物量或相对细胞数。成骨分化实验中，CM补充50 μM抗坏血酸-2-磷酸和2 mM β-甘油磷酸，处理MC3T3-E1至第6天；用von Kossa染色检测磷酸钙（CaP）沉积，用免疫细胞化学（ICC）检测OPN和OCN，并结合ImageJ半定量和方差分析。无人体或动物样本队列，细胞来源为ATCC和DSMZ。
研究结果：
2.1 不同处理对RAW 264.7巨噬细胞形态和功能反应
2.1.1 不同激活RAW 264.7巨噬细胞的形态：通过相差显微镜观察，100 ng/mL LPS处理组常见铺展或星状细胞，偶见伸长、纺锤形和成纤维样细胞，部分细胞含相亮空泡样结构，偶见双核；1 ng/mL LPS组形态更异质，包括圆形、多边形、星状、伸长和成纤维样细胞，偶见含囊泡和空泡的大而扁平细胞；DEX组星状和铺展形态较少，未处理对照组最少，以圆形或多边形细胞为主。所有组均见不同形状和数量聚集体。低倍镜下，100 ng/mL LPS组细胞更分散，1 ng/mL LPS组聚集更明显，DEX组聚集体密集紧凑，未处理组分布相对均匀。
2.1.2 不同激活RAW 264.7巨噬细胞的TNF-α分泌：通过ELISA检测，TNF-α浓度在M(LPS100)、M(LPS1)组显著高于Untreated，M(GC)组显著低于Untreated，且M(LPS100)显著高于M(LPS1)。
2.1.3 处理依赖的RAW 264.7巨噬细胞NBT还原：通过NBT还原检测formazan产生，最高平均产生见于100 ng/mL LPS处理组，其次为1 ng/mL LPS、未处理、DEX处理组，反映氧化活性差异。
2.1.4 巨噬细胞来源CM对L929细胞活力和形态的影响：通过MTT检测，所有CM培养的L929细胞活力与DMEM对照相当或更高，表明无CM具细胞毒性；50% M(LPS100)-CM平均活力最低。显微镜分析显示所有组高密度近汇合，1 ng/mL LPS来源CM组略低；LPS处理来源CM培养细胞主要呈伸长纺锤形，部分有细细胞质突起。
2.2 条件培养基中MC3T3-E1细胞的成骨分化
2.2.1 巨噬细胞来源条件培养基对MC3T3-E1相对细胞数的影响：通过CV测定，100% CM各组平均增殖均低于DMEM对照。探索性双因素重复测量ANOVA显示巨噬细胞条件、CM浓度及二者交互作用均有名义显著效应。25% M(LPS100)-CM低于M(LPS1)-CM和M(GC)-CM；M(LPS1)-CM和M(GC)-CM的50%和25%较100%促进增殖；Untreated-CM中50%平均增殖最高；100% M(GC)-CM抑制增殖最显著。
2.2.2 条件培养基培养第3天和第6天MC3T3-E1细胞的显微分析：第3天，所有CM和成骨培养基（OM）中细胞主要为棱柱状，具丝状伪足并形成细胞间连接；100% M(GC)-CM中常见环状排列，密度高于OM和DMEM。第6天，所有CM培养物高密度且汇合或近汇合；M(GC)-CM最汇合，尤其100%，以大多边形细胞、明显细胞核和片状伪足为主；其他CM组细胞异质，兼有片状和丝状伪足。浓度差异在第6天不如第3天明显。
2.2.3 条件培养基培养MC3T3-E1细胞成骨分化的评估：von Kossa染色在所有组阳性，CM和OM组CaP沉积较DMEM多；M(GC)-CM和M(LPS100)-CM染色最强，Untreated-CM次之，M(LPS1)-CM略弱于OM，25% CM仍可检测。OPN免疫反应性在所有组检出，Untreated-CM最明显，其次M(GC)-CM和M(LPS100)-CM，M(LPS1)-CM和对照较弱。OCN免疫反应性以M(GC)-CM最明显，Untreated-CM和M(LPS100)-CM较弱，M(LPS1)-CM和OM对照弱。100%与25% CM间无统一浓度依赖模式。
讨论部分总结：3.1指出，LPS和DEX处理用于建立M(LPS)和M(GC)条件，术语描述实验条件而非确定极化表型。100 ng/mL LPS处理巨噬细胞形态符合促炎活化，NBT还原最高，TNF-α最高；1 ng/mL LPS较低但仍高于未处理；DEX降低TNF-α和氧化活性。未处理巨噬细胞仍有基础活性。所有CM对L929无细胞毒性。3.2指出，CV显示100% CM均降低MC3T3-E1增殖，稀释效应依巨噬细胞状态而异。M(LPS)-CM支持更高增殖且TNF-α较高，M(GC)-CM增殖最低但成骨标志最强。CM含多种生物活性因子，不能仅归因TNF-α；CM浓度是生物相关实验变量。M(GC)-CM成骨最明显，未处理CM也支持成骨。早期促炎信号可能促进增殖和招募，随后修复样信号支持成熟。3.3认为不同巨噬细胞信号可能在不同愈合阶段有益，但不支持直接临床使用LPS、DEX或未表征CM；该模型可用于伤口愈合和慢性伤口研究，并可适配其他细胞，但缺乏相互细胞信号和完整微环境。3.4指出局限包括依赖小鼠细胞系和简化间接共培养，不能直接外推体内；第6天不覆盖终末成熟；染色半定量，CV间接；巨噬细胞表型标志有限；未进行中和试验，也未直接评估MC3T3-E1活力。
研究结论翻译：研究人员的研究表明，巨噬细胞来源条件培养基对前成骨MC3T3-E1细胞的成骨具有调节作用。CM浓度也以依赖巨噬细胞状态的方式改变前成骨细胞增殖。在100% CM浓度，两种M(LPS)-CM均与比M(GC)-CM和Untreated-CM更高的前成骨细胞增殖相关。然而，稀释产生不同效应：25% M(LPS100)-CM较DMEM和更浓M(LPS100)-CM显著降低增殖，而稀释的M(LPS1)-CM和M(GC)-CM较其100% CM支持更高增殖。然而，由1 ng/mL LPS激活巨噬细胞获得的CM显示有限能力产生显著von Kossa染色或OCN免疫反应性。相反，100 ng/mL M(LPS)条件显示更显著von Kossa染色但弱OCN免疫反应性。M(GC)-CM与显著成骨分化相关，表现为更显著von Kossa染色和OCN免疫反应性以及成骨细胞样形态，同时具有100% CM浓度中最低平均增殖值。来自未处理巨噬细胞的CM也支持成骨分化，与对巨噬细胞来源因子的早期成骨相关反应一致。在测试条件中，M(GC)-CM显示最显著总体成骨相关模式。这些发现描述第6天评估的早期反应，此时CM处理培养物汇合或近汇合，但不确认终末成骨细胞成熟或持续基质矿化。不同巨噬细胞条件之间100%和25% CM没有统一稀释依赖模式。各种处理和未处理巨噬细胞CM的不同效应表明，在测试条件下，巨噬细胞来源信号差异影响前成骨细胞增殖、分化和ECM产生之间的平衡。这种增殖和分化平衡对开发增强骨再生有效策略至关重要。精确确定应用于巨噬细胞的刺激浓度和随后应用于靶细胞的CM浓度也很重要，尤其建立促炎巨噬细胞活化条件时。最后，研究支持巨噬细胞作为骨组织工程关键调节者的作用，并突出其在再生医学免疫调节策略开发中的潜力。未来研究应探索这些调节涉及的分子通路，并评估这些发现在不同体内伤口愈合和再生模型中的适用性。
