《International Journal of Molecular Sciences》：Exosomal CircRNA_102619–miR-330-3p Interaction Regulates Osteosarcoma Progression and Metastasis by Forming the Lung Pre-Metastatic Niche
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骨肉瘤是最常见的原发性骨肿瘤，主要影响儿童和青少年。预转移微环境（pre-metastatic niche, PMN）是在临床可检测的转移病灶形成之前形成的特殊微环境。癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）
骨肉瘤是最常见的原发性骨肿瘤，主要影响儿童和青少年。预转移微环境（pre-metastatic niche, PMN）是在临床可检测的转移病灶形成之前形成的特殊微环境。癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）通过协调肺内PMN的形成，在触发肺转移中发挥关键作用。研究人员发现，由骨肉瘤来源的细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）递送的circRNA_102619在体外和体内均能促进肺成纤维细胞（lung fibroblasts, LFs）重编程为CAFs并促进PMN形成。高通量蛋白芯片分析显示，CAFs分泌的关键因子C-X-C基序趋化因子配体10（CXCL10）驱动骨肉瘤增殖、迁移以及对自然杀伤（natural killer, NK）细胞细胞毒作用的抵抗。此外，circRNA_102619作为miR-330-3p的海绵，从而调控CXCL10的产生。重要的是，体内研究证实骨肉瘤来源的EVs增强肺PMN形成，促进骨肉瘤进展和转移。抑制骨肉瘤来源的EVs代表了阻断骨肉瘤进展和转移的一种新策略。
骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，好发于儿童和青少年，肺转移是导致患者死亡的主要原因。预转移微环境（pre-metastatic niche, PMN）是指在临床可检测的转移灶形成之前，由原发肿瘤在远处器官营造的特殊微环境，有利于肿瘤细胞定植和生长。癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）通过协调肺内PMN的形成，在触发肺转移中起关键作用。然而，骨肉瘤细胞如何通过细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）重编程肺成纤维细胞（lung fibroblasts, LFs）及其分子机制仍不明确。研究人员开展的这项研究揭示了骨肉瘤来源EVs中的circRNA_102619通过调控肺成纤维细胞向CAFs转化，进而促进骨肉瘤进展和肺转移的机制。
研究人员从骨肉瘤143B细胞系中分离并鉴定了EVs，发现其携带的circRNA_102619可被LFs摄取，诱导LFs向CAFs转化，并促进PMN形成。通过高通量蛋白芯片分析，研究人员鉴定出CAFs分泌的关键因子CXCL10，该因子可促进骨肉瘤细胞增殖、迁移，并降低自然杀伤（natural killer, NK）细胞对其的杀伤效果。机制上，circRNA_102619作为miR-330-3p的海绵，解除miR-330-3p对CXCL10 mRNA的抑制，从而上调CXCL10表达。体内实验进一步证实，骨肉瘤来源EVs可教育肺PMN形成，增强肿瘤生长和肺转移，同时抑制NK细胞浸润和脱颗粒功能。该研究为骨肉瘤肺转移的预防和治疗提供了新靶点，即通过抑制骨肉瘤来源EVs或其下游circRNA_102619–miR-330-3p–CXCL10轴来阻断PMN形成和肿瘤转移。
主要关键技术方法包括：利用透射电子显微镜（TEM）、纳米粒子追踪分析（NTA）和Western blot对EVs进行表征；蛋白质芯片分析检测培养上清中的细胞因子谱；利用GEO数据库GSE96964进行circRNA表达谱分析；通过Circular RNA Interactome及六个miRNA数据库（miRDB、miRSystem、miRTarBase、EncorI、miRWalk、DIANA）预测miRNA靶点；采用双荧光素酶报告基因实验验证circRNA_102619和CXCL10 3′-UTR与miR-330-3p的直接结合；使用RT-qPCR、免疫荧光、免疫组织化学评估各分子表达；通过Transwell迁移、克隆形成、流式细胞术评估肿瘤细胞功能及NK细胞杀伤活性；并建立原位骨肉瘤小鼠模型（BALB/c裸鼠）进行体内验证。样本来源包括人骨肉瘤细胞系143B、HOS、MG63，人肺成纤维细胞系IMR-90，人NK细胞系NK-92MI以及BALB/c裸鼠。
2.1 外泌体CircRNA_102619促进LFs转化为CAFs及PMN形成
研究人员从143B细胞培养上清中分离EVs，TEM和NTA确认其典型形态和100–150 nm的粒径分布，Western blot显示CD81、ALIX、CD63阳性而calnexin阴性。PKH26标记实验显示IMR-90细胞在24 h内显著摄取EVs。经EVs处理后，IMR-90细胞形态变为更伸展的纺锤形，α-SMA和FAP表达上调，表明LFs被重编程为CAFs。利用GSE96964数据集的circRNA芯片分析显示，circRNA_102619在143B细胞和其EVs中表达最高，且与骨肉瘤细胞迁移能力呈正相关，提示circRNA_102619是介导EV功能的关键分子。
2.2 CXCL10是CAFs分泌的关键因子
蛋白质芯片分析显示，EV诱导的CAFs条件培养基中GM-CSF、IL-6、CCL20、MMP-9和CXCL10显著上升，其中CXCL10表达变化最明显。在供体骨肉瘤细胞中敲低circRNA_102619后，其EVs处理的IMR-90细胞中CXCL10 mRNA水平降低约30%，而直接在IMR-90中过表达circRNA_102619可恢复CXCL10表达。体内实验中，静脉注射骨肉瘤EVs的小鼠肺组织内circRNA_102619信号增强，α-SMA、FAP和CXCL10表达升高，证实EVs可在体内促进CAF激活和PMN形成。
2.3 CircRNA_102619作为miR-330-3p海绵促进CXCL10依赖性进展和转移
通过六个miRNA数据库与Circular RNA Interactome的交叉分析，仅miR-330-3p同时预测为circRNA_102619和CXCL10的靶向miRNA。双荧光素酶报告实验证实miR-330-3p可直接结合circRNA_102619和CXCL10 3′-UTR，且miR-330-3p mimic可降低CXCL10 mRNA表达。功能实验中，EV诱导CAFs的条件培养基可促进143B细胞迁移和克隆形成，该效应被CXCL10中和抗体阻断。NK细胞经CAF-CM预处理后再与143B细胞共培养，肿瘤细胞凋亡减少，NK细胞脱颗粒下降，而CXCL10中和可部分逆转这些效应，表明CXCL10介导了CAFs对NK细胞杀伤功能的抑制。
2.4 骨肉瘤EVs教育肺PMN促进体内进展和转移
在原位骨肉瘤小鼠模型中，骨肉瘤EVs预处理的荷瘤小鼠原发肿瘤体积和重量显著增加，肺部转移信号明显增多。免疫组化显示肺组织中Ki67和CXCL10表达升高，而NK细胞标志物NKp46和CD107a阳性细胞显著减少。结果表明，骨肉瘤来源EVs通过促进肺PMN形成，协同增强骨肉瘤生长、转移并抑制NK细胞抗肿瘤免疫。
讨论部分，研究人员总结了骨肉瘤EVs通过递送circRNA_102619促进LFs向CAFs转化，上调CXCL10分泌，从而驱动肿瘤细胞增殖、迁移及NK细胞免疫逃逸，最终促进肺PMN形成和转移。该研究还讨论了CXCL10相关信号（如CXCR3受体）在骨肉瘤迁移中的作用，并指出circRNA作为miRNA海绵的稳定性优势。同时，研究人员承认存在一些局限，例如需在更多细胞系和临床样本中验证circRNA_102619表达，以及需通过RNA pull-down或AGO2-RIP等实验进一步证实内源性海绵机制。研究结论可翻译为：总之，研究人员发现，由骨肉瘤来源EVs递送的circRNA_102619促进肺PMN形成和LFs向CAFs的重编程。CAFs分泌的关键因子CXCL10在体外和体内驱动骨肉瘤生长和转移。机制上，circRNA_102619通过海绵吸附miR-330-3p调控CXCL10表达。
