绵羊早期胚胎与胚胎干细胞中二价染色质区域的鉴定及H3K4me3/H3K27me3与染色质可及性的动态重塑

《International Journal of Molecular Sciences》：Identification and Dynamic Remodeling of Bivalent Chromatin Regions in Sheep Early Embryos and ESCs

　　

二价染色质（bivalent chromatin），由H3K4me³和H3K27me³标记，有助于维持发育基因处于蓄势状态。然而，绵羊胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）是否建立二价结构域仍不清楚。在本研究中，研究人员鉴定了二价染色质区域，并表征了绵羊早期胚胎和ESCs中H3K4me³、染色质可及性以及二价染色质相关基因表达动态。使用H3K4me³和H3K27me³峰之间>200 bp重叠阈值，研究人员在绵羊ESCs中鉴定出40,543个二价区域。这些区域优先发生于启动子，并富集于RNA加工、翻译和核糖核蛋白复合物生物发生。通过整合从MII卵母细胞至孵化囊胚的植入前发育过程中的Cleavage Under Targets and Tagmentation（CUT&Tag）、Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing（ATAC-seq）和RNA-seq数据，研究人员发现ESC定义的二价区域在H3K4me³富集和染色质可及性方面发生动态变化，并在发育阶段间呈现不同模式。二价相关基因也表现出阶段特异性表达模式，关键多能性和谱系相关转录因子，包括SOX2、SOX17、POU5F1和ZFP42，显示出不同的发育表达谱。此外，formative ESCs在二价区域表现出比primed ESCs更高的转录活性和染色质可及性。总之，这些结果表征了绵羊ESCs中二价染色质的基因组分布及其在植入前发育过程中的阶段特异性重塑，为进一步研究绵羊早期胚胎发育中的表观遗传调控提供了资源。

研究背景方面，胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）来源于囊胚内细胞团（inner cell mass, ICM），具有自我更新和多向分化能力，是研究早期胚胎发育的重要体外模型。小鼠和人ESCs已分别建立，但家畜稳定ESC系的建立仍具挑战，部分原因在于多能性调控网络和培养需求存在物种差异。近年绵羊ESCs已成功建立，但其多能性调控机制仍不清楚。表观遗传机制紧密控制Oct4、Sox2和Nanog等核心转录因子表达，其中H3K4me³（组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化）和H3K27me³（组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化）在自我更新和分化中起核心作用。H3K4me³富集于转录起始位点（transcription start sites, TSSs）附近，通常与转录活跃或允许性启动子相关；H3K27me³由Polycomb Repressive Complex 2（PRC2，多梳抑制复合物2）沉积，主要介导转录抑制。二者可在发育基因启动子共存，形成二价染色质（bivalent chromatin），使发育基因处于蓄势状态。小鼠和人ESCs中已鉴定大量二价启动子，且二价结构域随多能状态变化。然而，绵羊ESCs是否建立二价结构域尚不清楚，植入前发育中ESC定义的二价区域如何重塑也未解决。因此，研究人员开展本研究，旨在绘制绵羊ESCs二价染色质图谱，并追踪其在早期胚胎发育中的动态变化。

研究概况与意义方面，研究人员在绵羊ESCs中鉴定二价染色质区域，并整合CUT&Tag、ATAC-seq和RNA-seq数据，分析从MII卵母细胞到孵化囊胚的植入前发育过程中H3K4me³、染色质可及性和二价相关基因表达动态，同时比较formative ESCs与primed ESCs中二价区域的转录活性和染色质可及性。研究得出，ESC定义的二价区域在植入前发育中发生阶段特异性重塑，其相关基因表达具有异质性，且formative与primed ESCs在二价相关基因周围转录活性上存在差异。该研究为绵羊早期胚胎发育表观遗传调控研究提供了资源，并提示二价染色质状态与发育和多能性转变相关。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究人员使用本实验室建立的绵羊ESC系，并以当地屠宰场来源的湖羊（Hu sheep）卵巢，经体外成熟、体外受精和体外培养获得MII卵母细胞、2C、4C、8C、16C、桑葚胚、早期囊胚、扩张囊胚和孵化囊胚等样本；每个阶段设三个独立生物学重复。采用CUT&Tag检测H3K4me³和H3K27me³，ATAC-seq检测染色质可及性，RNA-seq检测转录；同时重分析Zhang et al.生成的绵羊早期胚胎scRNA-seq及formative和primed ESCs的RNA-seq/ATAC-seq公共数据。数据分析包括以>200 bp重叠定义二价区域、GO过代表分析（over-representation analysis, ORA）、k-means聚类、信号谱和统计可视化。

研究结果如下。2.1 绵羊ESCs中二价染色质区域的鉴定与表征：研究人员通过H3K4me³与H3K27me³CUT&Tag峰重叠，并以>200 bp重叠定义二价区域，在绵羊ESCs中鉴定出40,543个二价区域；敏感性分析显示，≥100 bp、≥300 bp和>50%相对重叠标准所得结果与主标准高度一致。这些区域优先发生于启动子，占38.40%，也分布于5′UTR、3′UTR、外显子、内含子、远端基因间区和紧邻下游区。长度分布显示二价峰可达200 bp至2000 bp，提示其形成延伸染色质区域。启动子分析显示，二价启动子的H3K4me³信号高于仅H3K4me³启动子，而H3K27me³信号低于仅H3K27me³启动子，表明两种标记共存且未相互减弱，H3K4me³信号在二价状态下甚至增强。GO ORA显示二价相关基因富集于核糖体解聚、tRNA代谢、Golgi囊泡运输和染色质环化等过程。

2.2 绵羊早期胚胎发育中二价染色质区域H3K4me³的动态变化：研究人员追踪二价区域H3K4me³信号，发现其在4C阶段最低，随后逐渐升高，至ESC阶段达到最高。k-means聚类将二价区域H3K4me³信号分为三类：C1区域早期和中期较低，囊胚升高而ESC下降，相关基因富集于核糖核蛋白复合物生物发生和核质运输；C2区域早期较高，16细胞后逐渐下降，相关基因富集于细胞突起组织正向调控和突触组织调控；C3区域早期低，囊胚和ESC阶段强上调，相关基因富集于细胞命运决定和胚胎器官形态发生。代表性基因组位点显示，H3K4me³在MII卵母细胞几乎缺失，早期卵裂阶段波动，随后在植入前发育中建立为启动子近端尖锐峰，并在ESCs中伴随H3K27me³沉积。结论是二价区域H3K4me³在植入前发育中呈阶段特异性动态。

2.3 绵羊早期胚胎发育中二价区域染色质可及性动态：研究人员检测从MII卵母细胞到孵化囊胚和ESC的二价区域可及染色质，发现ATAC信号呈明显阶段特异性波动，4C阶段可及性最高，随后卵裂阶段下降，向囊胚和ESC阶段再次升高。k-means聚类分为三类：C1区域早期和中期可及性较低，囊胚阶段明显升高，相关基因富集于小GTP酶介导信号转导和细胞-基质黏附；C2区域整个植入前发育中低且稳定，ESC阶段显著升高，相关基因富集于蛋白质定位至细胞周边、Wnt信号通路和突触组织调控；C3区域早期卵裂可及性较高，向囊胚进一步升高，ESC阶段减弱，相关基因富集于蛋白质定位和染色体分离。代表性位点显示ATAC信号在MII较低，植入前发育中呈非线性阶段特异性重塑，早期卵裂短暂峰值，囊胚和ESC阶段明显可及峰，同时H3K4me³和H3K27me³富集。结论是二价区域染色质可及性呈阶段特异性动态。

2.4 早期胚胎发育中二价相关基因的表达谱：研究人员分析绵羊早期胚胎bulk RNA-seq和scRNA-seq数据。Venn分析显示H3K27me³-only区域映射到5865个基因，二价区域映射到7818个基因，H3K4me³-only区域映射到1413个基因；由于基因可关联多种染色质状态，后续使用互斥基因集。表达分析显示三类染色质类别基因表达模式不同。bulk RNA-seq的k-means聚类将二价相关基因分为三类：C1在囊胚阶段高表达，包括SOX17、POU5F1和ZFP42；C2仅在ESC阶段表达，包括SOX2；C3从MII卵母细胞到桑葚胚持续表达。scRNA-seq显示SOX2在ICM和上胚层等多能细胞群高表达，SOX17在下胚层相关细胞特异表达，POU5F1在多能细胞群广泛高表达，ZFP42在早期卵裂阶段细胞显著富集，与bulk RNA-seq阶段特异性基本一致。结论是二价相关基因并非统一蓄势，而包含具有不同阶段特异性转录程序的亚群。

2.5 formative与primed ESCs中二价区域的转录活性和染色质可及性差异：研究人员重分析Zhang et al.生成的formative和primed绵羊ESCs公共RNA-seq和ATAC-seq数据。RNA-seq显示，formative ESCs在二价相关基因TSS周围转录活性高于primed ESCs，存在中等定量差异；ATAC-seq整体TSS周围也呈类似模式，formative ESCs可及性较高。进一步分别分析启动子近端和远端二价区域，发现formative ESCs在两类区域ATAC信号略高，但效应量接近零，提示两种多能状态间二价区域内染色质可及性差异可忽略。结论是formative与primed绵羊ESCs在二价相关基因周围转录活性存在差异，而启动子近端和远端二价区域内染色质可及性无有意义差异。

讨论部分总结：研究人员认为，鉴定和表征绵羊ESCs二价染色质基因组分布及其重塑，对理解其机制至关重要。ESC定义二价区域在植入前发育中H3K4me³富集和染色质可及性发生动态但不同的重塑。H3K4me³在4C阶段最低，向囊胚和ESC阶段升高；早期H3K4me³在TSS周围较弱，与早期胚胎中H3K4me³占据宽域、后期限制于TSS的既往发现一致，因此增加部分源于标记重分布而非净积累。相反，二价区域染色质可及性在4C阶段达到峰值，随后下降，再向囊胚和ESC阶段升高。这种相反变化提示阶段特异性染色质重塑。牛胚胎中也报道染色质可及性在植入前发育中显著重塑，并在胚胎基因组激活期附近明显变化；小鼠、人和牛胚胎比较表明早期染色质重塑具有部分保守特征，但具体时间和幅度可能反映物种特异发育程序。二价区域发育重塑伴随相关基因转录状态变化。二价结构域传统上被认为维持发育调控因子蓄势；但本数据中，二价相关基因在发育调控亚群中表达最高，并呈阶段变化，聚类显示分别偏好ESC、囊胚和MII至桑葚胚表达。POU5F1、SOX2、SOX17和ZFP42等代表性转录因子呈阶段依赖表达，与其多能性和谱系特化角色基本一致。这些发现表明二价相关基因具有异质且发育调控的转录状态。formative与primed ESCs代表多能性连续体上的不同状态，重分析显示formative ESCs在二价相关基因TSS周围转录活性高于primed ESCs，ATAC整体模式类似，但二价区域本身可及性差异很小。因此，二价区域染色质和转录状态与多能状态相关，而非绵羊ESCs不变特征。该数据集还可能有助于绵羊ESC生物学和生产：理解二价染色质建立和调控可为改进ESC衍生和培养提供依据；发育基因H3K4me³/H3K27me³状态可作为长期培养、扩增和遗传工程中ESC质量及多能状态稳定性的表观读出。稳定的绵羊ESCs是干细胞育种项目的前提，表观监测可能支持ESC介导的基因组编辑和优良等位基因传播。二价区域阶段特异性H3K4me³富集和染色质可及性动态，为体外胚胎生产系统中胚胎发育能力研究提供候选分子特征，但实际价值仍需验证。未来研究应通过功能获得或缺失实验检验候选转录因子，并结合组蛋白修饰、染色质可及性和基因表达靶向分析确定因果作用；整合H3K27ac、H3K4me1、DNA甲基化、RNA聚合酶II占有及单细胞分辨数据，可进一步阐明二价区域在胚胎发育和谱系特化中的建立与重塑。局限性包括：多组学图谱提供描述性框架，但未直接建立二价结构域建立、维持和解除的因果机制；转录因子和染色质修饰复合物如何协同调控发育调控启动子上的H3K4me³和H3K27me³，以及这些结构域在谱系承诺中如何解除，仍有待实验确定；二价染色质与DNA甲基化、增强子活性和高级染色质组织等其他调控层的关系未全面涉及。未来结合候选调控因子靶向扰动与ESC分化及早期谱系承诺中的时间分辨图谱，将有助于区分因果调控关系与相关性，并建立绵羊早期胚胎发育中二价染色质调控的更整合模型。

研究结论部分翻译：总之，研究人员的发现表明，ESC定义的二价区域在植入前发育过程中经历H3K4me³富集、染色质可及性和转录的动态、阶段特异性变化。formative与primed ESCs之间观察到的差异进一步表明，这些区域的染色质和转录状态随多能状态变化，而非保持恒定。这些发现共同提供证据表明，绵羊ESCs中的二价区域代表一种与发育和多能性转变相关的动态染色质状态，并为进一步研究其在早期胚胎发育中的潜在作用提供了基础。