N1-甲基假尿苷（m1Ψ）修饰mRNA转染树突状细胞高效生成功能性肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞

《International Journal of Molecular Sciences》：N1-Methylpseudouridine-Modified mRNA-Transfected Dendritic Cells Enable Efficient Generation of Functional Tumor Antigen-Specific Cytotoxic T Lymphocytes

　　

摘要专业翻译 肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的高效生成仍具挑战性。尽管基于mRNA的策略能够递送并表达多种肿瘤特异性抗原，但未修饰的mRNA可能触发先天免疫反应，从而抑制翻译。本研究探讨了1-甲基假尿苷（m1Ψ）修饰的mRNA能否增强人树突状细胞（DC）中的抗原表达，并促进抗原特异性CTL的诱导，以survivin和MART-1作为模型肿瘤相关抗原。值得注意的是，与未修饰的mRNA相比，m1Ψ修饰使DC中的蛋白产量提高了多达20倍。用m1Ψ修饰mRNA转染的DC能够从健康供者的自体外周血单个核细胞中高效启动survivin和MART-1特异性CD8+ T细胞，这一点已通过HLA I类肽–MHC dextramer染色得到证实。扩增的CTL系表现出强大的效应功能，包括IFN-γ产生、CD107a动员，以及对负载肽段的T2细胞和表达survivin或MART-1的肿瘤细胞系的强效细胞毒性。工程化mRNA变体在人HeLa细胞和DC中的翻译强烈依赖于poly(A)尾。综上，这些发现表明m1Ψ修饰显著增强了抗原表达，并支持功能性抗原特异性CTL的高效生成，为下一代基于mRNA的癌症疫苗和过继性T细胞疗法提供了一个有前景的平台。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

癌症的常规治疗手段，包括化疗、放疗和手术，仍是癌症管理的核心，但常受限于毒性和对健康组织的损伤。癌症免疫治疗通过利用免疫系统选择性识别和清除恶性细胞，提供了一种根本不同的治疗范式。在众多免疫治疗策略中，治疗性癌症疫苗已成为诱导肿瘤特异性T细胞反应的有前景的方法。基于信使RNA（mRNA）的疫苗因其良好的安全性、多功能性以及快速规模化生产的潜力而备受关注。体外转录（IVT）mRNA能够实现肿瘤抗原的瞬时表达，且无基因组整合风险，使其成为癌症疫苗的理想平台。然而，早期mRNA疗法的开发受限于稳定性差、翻译效率低以及先天免疫通路的强效激活。外源RNA可被多种先天免疫受体识别，包括内体Toll样受体（TLR3、TLR7和TLR8）以及胞质RIG-I样受体（RIG-I和MDA5）。这些通路的激活会诱导以I型干扰素和大量促炎细胞因子产生为特征的抗病毒反应。虽然先天免疫对外源RNA的识别对于宿主防御病毒感染至关重要，并有助于适应性免疫的激活，但过度感知治疗性mRNA可能通过抑制编码蛋白/抗原的翻译而产生不利影响。

RNA疗法发展中的一项重大进展是发现掺入修饰核苷可以大幅降低先天免疫识别。天然存在或化学修饰的核苷，包括2′-O-甲基核苷、假尿苷（Ψ）和N1-甲基假尿苷（m¹Ψ），能够减弱先天免疫传感器的激活并减少炎症细胞因子反应。在mRNA疗法中，用Ψ或m¹Ψ替代尿苷可显著增强mRNA的翻译能力并改善耐受性。这些发现对两款获批的COVID-19 mRNA疫苗的开发及临床成功起到了关键作用，确立了核苷修饰作为mRNA疗法变革性策略的地位。

树突状细胞（DC）在连接先天免疫和适应性免疫、抗原呈递和交叉呈递中发挥重要作用，已被广泛研究作为细胞癌症疫苗。这些方法通常涉及将自体单核细胞体外分化为DC，加载肿瘤抗原，然后回输患者体内。尽管此类策略可诱导可测量的抗原特异性免疫反应，但其临床疗效总体有限，提示所诱导T细胞反应的强度和质量可能不足以克服已建立肿瘤施加的免疫屏障。主要挑战在于肿瘤相关抗原（TAA）是自身蛋白，因此受到中枢和外周免疫耐受的制约。增加可供MHC I类呈递的TAA衍生肽的丰度是克服这一障碍的潜在策略。增强的细胞内抗原表达可增加DC表面展示的抗原衍生肽–MHC I类复合物的数量和多样性，从而提高激活逃避免疫耐受的低频肿瘤反应性T细胞的可能性。这些考量凸显了优化mRNA设计的重要性，不仅要最小化不必要的先天免疫激活，还要最大化DC内的抗原产生。尽管核苷修饰mRNA已在多种实验和临床环境中被广泛研究，但核苷修饰与未修饰mRNA在抗原表达及随后人DC中肿瘤特异性CTL诱导方面的直接比较仍有限。m¹Ψ修饰所实现的增强抗原表达，连同m¹Ψ介导的核糖体停滞，是否能转化为更有效的功能性肿瘤特异性CD8⁺ T细胞启动，仍是一个重要的未解问题。

本研究以survivin和MART-1作为模型TAA，探讨了m¹Ψ修饰对人DC抗原表达和T细胞启动的影响。Survivin是凋亡抑制蛋白家族成员，在多种人类恶性肿瘤中高表达，但在大多数正常成人组织中不表达或极低表达。MART-1（T细胞识别黑色素瘤抗原1），又称Melan-A，是一种黑色素细胞分化抗原，在大多数黑色素瘤中表达，是黑色素瘤定向T细胞免疫治疗中特征最明确的靶点之一。

二、研究内容与主要结论

研究人员系统研究了m¹Ψ修饰对mRNA在DC中抗原表达及肿瘤特异性CTL生成的影响。首先，在相同转录条件下合成了未修饰和m¹Ψ修饰的survivin IVT mRNA，并通过纤维素纯化去除dsRNA污染物。琼脂糖凝胶电泳确认了两种转录本的高完整性。J2 dsRNA特异性抗体检测显示，含尿苷的反应中dsRNA副产物信号显著强于含m¹Ψ的反应，表明m¹Ψ掺入抑制了IVT过程中dsRNA的形成。纤维素纯化后，两种mRNA制剂的J2反应性均显著降低且相当，确认了纯化过程有效去除dsRNA污染物。在人未成熟DC（iDC）中，含尿苷的mRNA转染诱导了大量IFN-β和TNF-α产生，而m¹Ψ修饰mRNA仅引发极少的细胞因子产生，这一模式在五个独立IVT mRNA制备中可重复观察到。在蛋白表达方面，m¹Ψ修饰mRNA诱导了survivin蛋白的强表达，而未修饰mRNA的表达极低或常检测不到，定量分析显示m¹Ψ修饰使survivin表达提高了约20倍。在循环常规树突状细胞亚群cDC1和cDC2中，m¹Ψ修饰也分别使survivin表达提高了约6–10倍。

在T细胞启动方面，用m¹Ψ修饰survivin mRNA转染的成熟DC反复刺激自体T细胞后，诱导了显著更高频率的survivin特异性CD8⁺ T细胞，针对TLPPAWQPFL_5–14和LMLGEFLKL_96–104两个表位的dextramer阳性细胞频率分别达到13% ± 3.5%和20% ± 6%，而用未修饰mRNA转染DC刺激的培养物中仅为1.5% ± 1%和2.5% ± 0.5%。类似地，m¹Ψ修饰的MART-1 mRNA在iDC和cDC1中的翻译效率分别比未修饰mRNA高约10倍和18倍，并诱导了约17.2% ± 6.5%的MART-1 dextramer阳性CTL，而未修饰组仅为2.5% ± 0.62%。功能评估显示，这些CTL在抗原特异性刺激后表现出强大的CD107a动员和IFN-γ产生。在细胞毒性实验中，survivin和MART-1特异性CTL能有效杀伤负载相应肽段的T2细胞，MHC I类阻断抗体（W6/32）可将杀伤率降低约50%。更重要的是，survivin特异性CTL能有效清除HLA-A2⁺/survivin⁺的U266细胞，而对HLA-A2^?/survivin⁺的K562细胞基本无杀伤；MART-1特异性CTL能有效杀伤HLA-A2⁺/MART-1⁺的FM-57黑色素瘤细胞，而对HLA-A2^?的SK-MEL-28细胞活性很低，表明CTL能识别内源性加工的抗原并以HLA-A2限制性方式杀伤肿瘤细胞。

在mRNA结构元件研究方面，研究人员为每种抗原生成了三种mRNA变体，分别包含5′和3′UTR、仅5′UTR或仅Kozak序列。所有非poly腺苷化转录本在HeLa细胞或iDC中均无可检测的翻译，而酶法添加poly(A)尾后，三种构型的转录本均产生可检测的抗原表达，其中同时包含5′和3′UTR的转录本表达最高。

三、关键技术与方法

本研究采用了以下关键技术方法：体外转录（IVT）合成mRNA，使用抗反向帽类似物（ARCA）加帽，并通过纤维素纯化去除dsRNA副产物；从健康HLA-A2⁺供者的外周血单个核细胞（PBMCs）中分离单核细胞并分化为未成熟DC（iDC），同时通过磁激活细胞分选（MACS）分离循环cDC1和cDC2亚群；使用LipoFectMax脂质转染试剂将mRNA递送至DC；通过Western blotting评估抗原蛋白表达；使用肽–MHC I类dextramer染色和流式细胞术定量抗原特异性CD8⁺ T细胞；通过CD107a动员和IFN-γ ELISA评估CTL功能；使用流式细胞术为基础的细胞毒性实验和乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评估肿瘤细胞杀伤；通过酶法添加poly(A)尾构建不同UTR构型的mRNA变体。

四、讨论与结论

本研究的核心发现是m¹Ψ修饰在人DC中显著增强了抗原表达，并将这一改善转化为更高效的肿瘤特异性功能性CTL生成。m¹Ψ修饰同时减弱了先天炎症反应并增强了抗原表达。增强的抗原表达与增加的抗原特异性CTL频率之间存在关联，尽管研究人员指出不能排除m¹Ψ修饰相关的细胞因子产生差异、DC功能状态、抗原持续呈递或核糖体停滞激活核糖体相关质量控制通路等其他效应也可能对T细胞启动差异有所贡献。生成的CTL能够识别内源性加工的肿瘤抗原并通过经典MHC I类通路杀伤肿瘤细胞，这对过继性T细胞疗法（ACT）具有潜在意义。从健康供者PBMCs生成肿瘤特异性CTL可能在造血干细胞移植后环境中特别相关，供者来源的靶向白血病相关抗原（如WT1或survivin）的抗原特异性CTL可能增强移植物抗白血病（GVL）效应，同时减少与移植物抗宿主病（GVHD）相关的广泛同种异体反应性T细胞的转移。关于mRNA结构要求，研究结果显示了poly(A)尾对survivin和MART-1 mRNA翻译的严格依赖性，这与Esprit等人报道的简化IVT mRNA构建体无需poly(A)尾即可实现抗原呈递的发现不同，可能反映了编码区和/或整体mRNA架构的差异。

结论：本研究确定核苷修饰是人DC中mRNA性能的重要决定因素，并建立了增强抗原表达与功能性肿瘤特异性CTL有效生成之间的关联。m¹Ψ修饰同时减弱了先天炎症反应并增强了抗原表达，促进了survivin和MART-1特异性CD8⁺ T细胞的高效扩增，这些细胞具有强大的抗原依赖性效应功能以及识别和杀伤呈递内源性加工抗原的肿瘤细胞系的能力。研究进一步表明，mRNA结构元件特别是poly(A)尾可显著影响抗原表达，应针对个体肿瘤抗原构建体进行经验性优化。这些结果为将m¹Ψ修饰mRNA整合到DC为基础的癌症疫苗和ACT平台提供了机制和功能上的依据。