《International Journal of Molecular Sciences》：Protein Self-Assembly as a Design Principle for Enzyme Immobilisation in Biocatalysis
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酶固定化对于将生物催化过程从实验室转化为工业应用至关重要，其通过提高酶稳定性、回收性和可重复使用性来实现这一目标。它支撑着制药、生物燃料和食品生产中的可持续工艺，但传统固定化策略存在固有的权衡取舍。共价连接可防止酶泄漏，但可能扭曲活性位点；而物理
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酶固定化对于将生物催化过程从实验室转化为工业应用至关重要，其通过提高酶稳定性、回收性和可重复使用性来实现这一目标。它支撑着制药、生物燃料和食品生产中的可持续工艺，但传统固定化策略存在固有的权衡取舍。共价连接可防止酶泄漏，但可能扭曲活性位点；而物理吸附能更好地保持酶构象，但允许酶泄漏。此外，基于载体的方法常遇到传质限制，并可能需要外部交联剂，阻碍了更广泛的工业应用。合成生物学和材料科学的最新进展加速了用于生物催化的蛋白质基材料的发展。本综述将蛋白质自组装视为酶固定化的统一设计原理，使其能够在相对温和的条件下进行可编程组装，以克服传统策略的关键局限性。研究人员讨论了天然来源的结构，如细菌微 compartment（bacterial microcompartments），以及工程化系统，包括病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）、弹性蛋白样多肽（elastin-like polypeptides, ELPs）和SpyTag/SpyCatcher（ST/SC）系统，这些系统支持可编程的酶组织化，并能够实现区室化的多酶级联反应。在此基础上，研究重点聚焦于催化活性包涵体（catalytically active inclusion bodies, CatIBs）。作为一种稳健的、本质上自固定化的蛋白质聚集体，CatIBs代表了一种简化的、无载体平台，为工业生物催化提供了潜在的过程和成本优势。
论文主体内容学术总结
1. 现代生物催化中的酶固定化
酶是支撑生物过程和技术应用的关键蛋白质类别。生物催化已将多种酶介导的反应从实验室研究转化为商业应用，涵盖制药、精细化学品和食品技术领域。游离酶在溶液中的催化效率虽高，但存在稳定性差、回收困难和一次性使用成本高等问题。传统酶固定化策略根据酶与载体之间的分子相互作用性质可分为非共价（物理吸附或包埋）、共价（化学键合）或混合机制。载体基方法涉及将酶附着在无机、有机、纳米、聚合物或陶瓷等惰性载体上，但常面临传质限制、载体稀释导致体积活性降低、规模化时均匀负载困难等瓶颈。化学交联剂介导的共价固定化虽提供强健的酶-载体相互作用，但可能引起酶残基不可逆修饰、活性位点扭曲、构象限制及扩散屏障等问题。现有综述多将固定化策略、自组装蛋白系统和包涵体视为独立领域，而本综述明确将这些领域整合，将蛋白质自组装定位为生物催化中酶固定化的统一框架，强调结构-功能关系和CatIBs在此设计版图中的角色。
2. 蛋白质自组装作为设计原理
自然界中许多蛋白质具有自组装成高阶结构的内在能力，该过程由氢键、静电力和疏水效应等非共价相互作用驱动，在热力学控制下形成结构明确的超分子结构。基于蛋白质的平台利用自组装提供生物相容性、位点特异性的支架，其催化性能受架构依赖的酶定位、化学计量和微环境控制影响。自组装过程可通过基因编码实现，并与生物分子偶联策略结合，实现酶在支架内的受控定位和精确定义化学计量。多种自组装系统已被应用于酶固定化：胶原样多肽（CLP）和弹性蛋白样多肽（ELP）融合系统构建的超氧化物歧化酶（SOD）和D-氨基酸氧化酶（DAAO）微孔网络（PMN）减少了副产物（H2O2）诱导的氧化失活，DAAO催化效率提高约1.7倍，10次循环后保留约80%活性。ELP支架结合SpyTag/SpyCatcher（ST/SC）系统构建的多酶纳米结构实现了高酶密度组装，甲萘醌途径酶（MenF、D3’-MenD、D4’-MenH）的模块化附着使产物产率达到游离酶的94%。细菌encapsulin纳米区室的孔工程化扩展了大分子底物和辅因子通透窗口，共包埋辅因子回收酶磷酸脱氢酶（PTDH）使工程化壳体的转化率提高约84%。工程化病毒样颗粒（VLPs）实现脱氢酶与伴侣还原酶系统的共包埋，通过底物通道效应提高整体反应速率。ST/SC系统通过SpyTag中天冬氨酸残基与SpyCatcher中赖氨酸残基间的自发共价异肽键形成实现模块化组装，在多酶级联中可缩短中间体扩散距离，如麦芽寡糖基海藻糖合酶（MTS）和海藻糖水解酶（MTH）组装后海藻糖产率提高58.5%，反应峰值提前10小时。尽管自组装系统具有优势，但催化结果受扩散、酶堆积密度和支架架构之间权衡的约束，过度限制、过密堆积或不利孔架构会限制底物可及性。
3. 包涵体作为蛋白质基生物材料的天然实例
大肠杆菌（Escherichia coli）异源基因表达是重组蛋白和酶生产的稳健平台，但包涵体（IBs）长期被视为非功能性生物废物。近期研究表明IBs可含有大量活性、天然样折叠蛋白。CatIBs作为蛋白质基固定化中的亚类，在异源过表达过程中于细胞内形成，将酶生产和固定化整合为单一工艺步骤，可减少层析纯化和额外固定化步骤的需求。CatIBs的残余活性因聚集诱导融合伴侣和堆积密度的不同而差异显著，系统比较中约为对应可溶酶的1-2%至10-18%。CatIBs的概念优势在于占据低成本载体固定化与结构更精细的蛋白质自组装系统之间的中间位置，其操作优势包括：减少纯化瓶颈，细胞裂解和最小化处理后即可直接使用聚集的活性蛋白；体内形成稳健生物催化剂，细胞内形成固态机械稳定结构；通过共表达实现高容量共固定化，支持多酶级联反应。
4. 功能性包涵体：当前知识、工程原理与剩余挑战
与早期将IBs视为无活性聚集体的观点相反，多项研究报告了IBs内存在结构化微结构域和天然样折叠核心。IB形成的精确机制仍存争议，现有证据表明其具有蛋白质特异性，由动力学折叠中间体的错误折叠引发。体内研究显示宿主蛋白质稳态中存在动态平衡，驱动IB同时聚集和分解。活性保留受表达条件、融合设计和内部IB结构影响。
4.1 功能性IB形成的机制和结构基础
Carrió等人的研究首次证明了由口蹄疫病毒（FMDV）VP1衣壳结构域融合形成的β-半乳糖苷酶IBs（VP1LAC）的有序组织，报道了不溶性VP1LAC量与平均IB体积随诱导时间的线性相关。分子水平上，疏水塌缩、β-折叠堆积和聚集热点在驱动IB形成中发挥重要作用。光谱和显微分析证明IBs内存在淀粉样样交叉β结构与天然样结构域共存。计算工具和序列分析已能识别促成IB形成的聚集倾向区域（APRs），高分辨率核磁共振（NMR）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析揭示IBs内广泛的保护和大量天然样结构特征。
4.2 功能性IB的工程策略
基于聚集诱导融合标签和间隔连接子的长度与柔性工程策略已被探索。Diener等人于2016年引入"CatIBs"术语，利用平行卷曲螺旋结构域（TdoT）作为融合伴侣支持三种结构不同酶的CatIB形成。系统比较报告不同融合设计的残余活性为约1-2%对比约10-18%。多种天然和合成功能肽，包括表面活性剂样和两亲性自组装肽，已被用作IB生产的聚集诱导标签。Küsters等人证明疏水标签和刚性PT连接子影响CatIB形态，增强活性、体积生产率和稳定性。Huang等人引入绿色荧光蛋白（GFP）作为聚集促进融合伴侣，证明连接子柔性对最终IB活性和特性的关键作用，刚性连接子的相对特异性活性高于柔性连接子。Gil-Garcia等人利用天然卷曲螺旋ZapB结构域形成基于α-螺旋的IBs，保留天然样状态和高功能保留率。
4.3 功能性IB的应用
IBs已在多种生物技术和生物医学应用中得到探索。生物医学应用中，IBs已被证明可促进细胞粘附、增殖和体外伤口愈合，组织工程中通过图案化IB表面和酶储库实现应用。IBs已被工程化为纳米颗粒递送系统，展示哺乳动物细胞内化和治疗蛋白持续释放能力。基于IB的颗粒疫苗已引发稳健的临床前细胞免疫反应。磁功能化已被探索以促进催化剂分离和再利用，如GalU-CatIBs在UDP-葡萄糖合成中重复使用达50次。在多酶级联中，J?ger等人通过卷曲螺旋结构域融合共表达和共固定化苯甲醛裂解酶和醇脱氢酶，形成Co-CatIBs，实现两步级联生产(1R,2R)-1-苯基丙烷-1,2-二醇（PPD），两种酶在Co-CatIBs中的残余活性分别比可溶对应物高约7倍和15倍。?l?ücü等人成功在填充床流动反应器中实施CatIBs，不对称还原氯代苯乙酮，系统运行280小时无显著活性损失，对映体过量值达98%。Dong等人探索ST/SC化学诱导CatIBs-STC形成，聚集与寡聚状态强相关，八聚体亮氨酸脱氢酶约85.44%活性保留在聚集体中。
4.4 当前基于IB技术的局限与挑战
CatIB开发的优化工作仍 largely 酶特异性，缺乏可转移的设计原理。规模化生产同时保持一致的IB特性仍具挑战。研究常集中于有限蛋白质或融合标签，限制了对多样化蛋白质类别的扩展。融合标签对蛋白质折叠动力学和细胞质量控制机制的影响研究不足。预测建模和IB形成的可扩展控制仍有限，需要先进结构技术和计算建模结合以表征构象和结构异质性。工业应用方面，许多研究局限于实验室规模或体外分析，关于CatIBs在工业或生物医学环境中长期稳定性、可扩展性和性能的数据稀缺。
5. 生物催化的新兴自组装策略
5.1 朝向理性工程化自组装结构域
ST/SC系统被扩展形成催化活性磁性蛋白聚集体（CatMPAs），SpyTag融合铁蛋白支架与SpyCatcher融合醇脱氢酶（RADH）在细胞裂解后偶联，室温5天无活性损失（101.3%保留率）。高通量筛选结合Golden Gate Assembly和贝叶斯优化（Thompson采样）生成63个BsGDH-CatIB变体，识别出TDoT-PT-BsGDH等高性能构建体，刚性PT连接子优于柔性设计，手动工作量减少88%。理性设计识别截短PagPβ-桶外膜蛋白通过高β-折叠含量和疏水性促进IB形成，优化PagP变体使Magainin II融合蛋白积累增加44.3-60.5%。工程化四肽重复亲和蛋白（TRAPs）作为支架组装多酶系统（FDH-AlaDH-ωTA），L-丙氨酸生产率提高达5倍。酶-无机杂化纳米花与Cu3(PO4)2自组装使大豆过氧化物酶（SBP）活性提高约446%。利用非共价蛋白质-蛋白质相互作用结构域（PDZ、GBD、SH3），Hertel等人制造全酶水凝胶（AEHs）用于连续生物催化，SH3和PDZ连接系统在30小时内维持>70%转化率。
5.2 可逆和可编程蛋白质组装作为新兴设计机遇
光诱导可逆自组装系统利用改进的光诱导二聚体（iLID）模块，十二聚体腈水解酶与AsLOV2-SsrA结构域基因融合，470 nm蓝光照射触发快速二聚化和超分子组装成环状片状结构，黑暗中解离恢复低阶寡聚状态，至少5次光/暗循环可逆组装/解组装，体外4次重复使用后保留约90%活性。支架介导组装调控工具（SMART）平台利用谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）细胞表面展示，整合正交交联支架与ST/SC和SnoopCatcher/SnoopTag，两酶级联中海藻糖生产率达20.4 g·L-1·h-1，5 L生物反应器放大后产215.4 g·L-1海藻糖，转化率71.8%。Yu等人通过将硒代半胱氨酸（Sec）掺入稳定蛋白1（SP1）支架构建谷胱甘肽过氧化物酶模拟物，Ni2+驱动SP1环组装成纳米管，通过多价金属配位限制底物进入活性位点实现"关闭"活性，EDTA螯合Ni2+诱导解离恢复活性。
5.3 展望
蛋白质基系统已验证蛋白质自组装作为可行固定化策略，但从概念验证转化为稳健可扩展的工业平台仍未解决。未来进展将依赖于建立跨酶类别的预测性和可转移设计策略，而非识别新型自组装蛋白。机器学习（ML）算法与结构生物学数据整合可扩展至评估酶与自组装蛋白支架的兼容性。结合理性蛋白设计、数据驱动建模和合成生物学，可为工业背景下酶固定化提供更可控和特定应用的自组装平台。人工智能引导的从头设计与全原子分子动力学（MD）模拟结合的高通量迭代流程已用于系统延长β-链并最大化氢键网络，设计出具有卓越机械和热抗性的超稳定蛋白，这些设计原理向CatIB形成酶的转化仍待探索。细胞游离蛋白质合成（CFPS）系统可实现自组装蛋白变体的快速生产和体外评估，支持预测设计原理在工业相关生物催化系统中的实验验证。
6. 结论
本综述将蛋白质自组装定位为生物催化中生成稳健高效酶固定化系统的统一设计策略。新兴方法包括合成蛋白纳米区室、ST/SC系统和生物正交相分离策略，实现多酶级联的可编程空间排列和可控相互作用。从过程角度看，CatIBs等自组装酶系统提供简化回收、改善操作稳定性和无需额外载体材料即可重复使用的实际优势。CatIBs催化性能关键取决于融合设计参数，包括连接子组成、聚集诱导标签和表达架构，需要经验优化和系统筛选。高通量筛选、自动化和贝叶斯优化进展加速了有效融合构建体和组装构型的识别，但将这些见解转化为广泛预测性和可转移的设计框架仍是开放挑战，许多现有解决方案仍具有酶和情境特异性。
