AIRE缺陷损害mESC向TEP分化并加速NOD/Ltj小鼠1型糖尿病：ECM-受体互作通路改变

《International Journal of Molecular Sciences》：AIRE Deficiency Impairs Thymic Epithelial Progenitor Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells and Accelerates Type 1 Diabetes in NOD/Ltj Mice

　　

自身免疫调节因子（autoimmune regulator, AIRE）对中枢免疫耐受至关重要，但其在胸腺上皮细胞（thymic epithelial cell, TEC）分化与发育中的作用仍未完全阐明。为此，研究人员在小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells, mESCs）中敲低AIRE，利用RNA测序分析胸腺上皮祖细胞（thymic epithelial progenitor, TEP）分化，并在NOD/Ltj小鼠中进行胸腺AIRE敲低以评估1型糖尿病（type 1 diabetes, T1D）发病机制。AIRE敲低显著降低EpCAM1⁺细胞中K5⁺/K8⁺ TEP的比例，并改变ECM–受体互作通路，表现为SPP1下调以及Fn1和CD44上调。重要的是，使用抗shRNA的拯救载体重新表达AIRE可部分逆转这些分子变化，并部分恢复TEP分化。在体内，胸腺AIRE敲低加速血糖升高、加重胰岛炎，并降低T1D相关组织特异性抗原（tissue-specific antigens, TSAs）（INS2、GAD67）和成熟标志物（CD80、MHC-II）的表达。重要的是，SPP1、Fn1和CD44的变化在体外和体内模型之间一致。此外，AIRE缺陷增加CD4⁺单阳性胸腺细胞，降低脾脏Treg频率，并增强抗原特异性T细胞增殖和活化。总之，这些发现表明，AIRE缺陷损害TEP分化并改变ECM-受体通路，而胸腺AIRE缺陷损害免疫耐受并加速NOD/Ltj小鼠T1D进展。

自身免疫调节因子（autoimmune regulator, AIRE）是中枢免疫耐受的关键调节因子，其基因最初被发现为自身免疫多内分泌病-念珠菌病-外胚层营养不良（autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy, APECED）的致病基因。AIRE mRNA在胸腺中高表达，主要位于髓质胸腺上皮细胞（medullary thymic epithelial cells, mTECs）。AIRE通过驱动广泛的组织特异性抗原（tissue-specific antigens, TSAs）转录，介导胸腺细胞阴性选择，从而建立中枢免疫耐受。AIRE也被认为是胸腺上皮细胞（thymic epithelial cell, TEC）成熟的重要调控因子；mTEC发育经历MHC^lo、CD80^lo、AIRE^-未成熟阶段，MHC^hi、CD80^hi、AIRE^-前成熟阶段，以及MHC^hi、CD80^hi、AIRE⁺成熟阶段。然而，AIRE在TEC成熟中的精确作用及其机制仍未完全阐明。研究人员此前已证明，小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells, mESCs）可在体外高效诱导分化为胸腺上皮祖细胞（thymic epithelial progenitor, TEP），移植后可进一步分化为皮质胸腺上皮细胞（cortical thymic epithelial cells, cTECs）和mTECs，重建胸腺结构并促进胸腺细胞发育。这为研究AIRE调控免疫耐受提供了细胞模型和实验平台。1型糖尿病（type 1 diabetes, T1D）是T细胞介导胰腺β细胞破坏的器官特异性自身免疫病，非肥胖糖尿病（non-obese diabetic, NOD）小鼠是公认的自发性T1D模型，可重现人类T1D的免疫特征、病理进展和临床表现。因此，研究人员采用mESC-TEP分化模型结合AIRE shRNA慢病毒敲低，研究AIRE在mESC向TEP分化中的作用，并通过抗shRNA的Aire表达载体进行拯救实验；同时在NOD/Ltj小鼠中敲低胸腺AIRE，观察T细胞发育和T1D发病。研究结论表明，AIRE敲低降低mESC向TEP分化效率并改变细胞外基质（extracellular matrix, ECM）-受体互作通路；恢复AIRE可部分逆转相关分子变化和TEP分化缺陷；胸腺AIRE缺陷损害免疫耐受并加速T1D进展。这为AIRE在TEC发育和免疫耐受中的作用提供了新的功能见解。

在关键技术方法方面，研究人员使用B6 mESCs，转导AIRE shRNA慢病毒并筛选稳定细胞系；通过诱导定型内胚层（definitive endoderm, DE）及后续TEP分化方案建立mESC-TEP模型。体外采用RNA测序、qPCR和Western blot分析分子变化，并用抗shRNA的Aire表达载体进行拯救。体内使用雌性4周龄NOD/Ltj小鼠，来源为北京HFK Bioscience Co., Ltd.（北京，中国），经胸腺内注射AIRE shRNA或对照慢病毒，监测血糖并定义T1D为连续两次随机血糖≥11.1 mmol/L。研究还采用流式细胞术、组织病理学和免疫荧光分析胸腺细胞亚群、脾脏T细胞增殖活化、Treg频率及胰腺病理。动物程序获贵州医科大学伦理委员会批准。

研究结果部分：
2.1 AIRE敲低mESCs的建立与表征：研究人员用AIRE shRNA慢病毒转导mESCs并经嘌呤霉素选择建立稳定单克隆；Western blot显示AIRE蛋白显著降低。AIRE shRNA与对照shRNA mESCs均显示碱性磷酸酶活性，并表达GFP和SSEA1，说明遗传修饰后仍维持未分化状态。诱导分化后，两组均出现EpCAM1⁺且共表达K5和K8的TEP样细胞，但AIRE敲低组EpCAM1⁺细胞中K5⁺/K8⁺双阳性比例显著降低，表明AIRE缺陷抑制mESC向TEP分化。
2.2 AIRE缺陷改变ECM-受体互作通路，恢复AIRE可挽救相关分子变化和TEP分化缺陷：RNA-seq的KEGG富集分析显示，ECM-受体互作通路是AIRE敲低后显著改变的通路之一。差异表达基因分析显示，AIRE敲低mESC-TEPs中Spp1和Aire下调，Fn1和Cd44上调。qPCR验证Aire和Spp1降低、Fn1和Cd44升高，未处理组与对照shRNA组在这些基因上无显著差异。拯救实验中，抗shRNA的Aire表达载体恢复AIRE表达，并在mRNA和蛋白水平部分逆转SPP1、FN1和CD44变化；流式细胞术显示恢复AIRE后EpCAM1⁺细胞中K5⁺/K8⁺ TEP样细胞比例增加。该结果提供功能证据，表明AIRE缺陷参与ECM相关分子改变和TEP分化受损。
2.3 胸腺AIRE敲低加速NOD/Ltj小鼠T1D进展：研究人员将AIRE shRNA慢病毒直接注射入NOD/Ltj小鼠胸腺，连续4周监测血糖。AIRE shRNA组血糖较对照和未处理组更快升高，部分小鼠在注射后2周即出现明显T1D；对照shRNA组无糖尿病率保持100%，AIRE shRNA组无糖尿病率逐渐下降，至第9周为0%。胰腺H&E染色显示，未处理和对照组胰岛结构完整、淋巴细胞浸润极少；AIRE shRNA组胰岛结构破坏并伴明显淋巴细胞浸润，提示严重胰岛炎。免疫荧光显示AIRE shRNA组中胰岛素阳性（Ins⁺）β细胞减少，CD45⁺炎症细胞广泛浸润。该结果表明胸腺AIRE敲低加重胰岛炎症并加速T1D发病。
2.4 胸腺AIRE敲低后胸腺成熟标志物、T1D相关TSAs和ECM-受体互作分子表达改变：免疫荧光确认AIRE shRNA组胸腺髓质AIRE蛋白降低。qPCR显示，与未处理和对照shRNA组相比，AIRE shRNA组胸腺中AIRE、mTEC成熟标志物CD80和MHC-II、T1D相关TSAs GAD67和INS2表达显著降低；同时Fn1和CD44表达增加，SPP1表达降低，与体外结果高度一致。
2.5 胸腺AIRE敲低增加NOD/Ltj小鼠CD4⁺单阳性T细胞：流式细胞术显示，AIRE shRNA组CD4⁺单阳性（CD4 single-positive, CD4SP）胸腺细胞比例显著增加，CD4⁺CD8⁺双阳性（double-positive, DP）胸腺细胞减少。该结果提示AIRE缺陷损害阴性选择，导致胸腺中CD4⁺自身反应性T细胞清除缺陷。
2.6 胸腺AIRE敲低促进NOD/Ltj小鼠外周T细胞增殖/活化并降低Treg频率：脾细胞在抗CD3抗体或胰岛素抗原刺激5天后，流式检测CD4⁺和CD8⁺ T细胞中Ki67⁺增殖细胞比例。AIRE shRNA组CD4⁺和CD8⁺ T细胞，包括胰岛素抗原特异性T细胞，增殖显著增强。CD69在CD4⁺和CD8⁺ T细胞上显著上调，表明外周T细胞活化增强。脾脏CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）比例显著降低。该结果表明胸腺AIRE缺陷促进自身反应性T细胞扩增并降低外周免疫耐受。

讨论部分总结：研究人员证明，AIRE敲低降低mESC向TEP分化效率并改变ECM-受体互作通路；使用抗shRNA的Aire拯救载体重新表达AIRE可部分逆转相关分子变化并改善TEP分化缺陷，为AIRE参与这些过程提供功能支持。体内胸腺AIRE缺陷损害胸腺阴性选择，促进外周T细胞增殖和活化，减少脾脏Treg频率，共同加速T1D发病。胸腺是T细胞发育和成熟的主要器官，阳性选择确保MHC限制，阴性选择清除自身反应性T细胞克隆以建立中枢耐受。mTECs呈递TSAs，高亲和力T细胞克隆经阴性选择被删除，低亲和力克隆逃逸至外周并可能成为自身反应性T细胞。AIRE在mTECs中高表达并驱动大量TSA编码基因转录。在NOD/Ltj小鼠中，胸腺AIRE敲低导致胰岛结构严重破坏、CD45⁺炎症细胞浸润和Ins⁺β细胞丢失；分子上CD80、MHC-II、INS2和GAD67降低；CD4SP胸腺细胞增加、DP胸腺细胞减少，外周T细胞增殖活化增强，提示TSA表达受损和T细胞发育扰动，导致阴性选择受损和外周耐受缺陷。脾脏Treg频率降低进一步提示外周免疫耐受受损。TECs来源于定型内胚层，cTECs和mTECs均起源于共同胸腺上皮祖细胞；mESCs具有无限自我更新和多能性。研究人员此前证明mESC来源TEP移植后可分化为cTECs和mTECs，重建胸腺结构并支持胸腺细胞发育。本研究中AIRE敲低显著降低TEP分化效率，转录组分析发现ECM-受体互作通路改变，Spp1下调、CD44和Fn1上调。拯救实验部分逆转mRNA和蛋白变化，并增加K5⁺/K8⁺ TEP样细胞。胸腺AIRE敲低小鼠中Cd44、Spp1和Fn1表达变化与体外一致。CD44是广泛分布的细胞表面糖蛋白，介导细胞-ECM黏附、淋巴细胞归巢、T细胞活化和迁移。SPP1（osteopontin，骨桥蛋白）主要通过β1和β3整合素受体及CD44受体调节白细胞黏附和迁移；SPP1与T细胞上整合素和CD44受体相互作用可促进Th1分化并抑制Th2发育，从而增强细胞免疫。AIRE与SPP1、FN1和CD44在TEC分化中的精确分子机制尚待进一步阐明。研究局限包括：mESC来源TEP的鉴定主要基于EpCAM1和K5/K8表达，需更多表型或功能标志物；尽管所有处理小鼠均接受相同胸腺内慢病毒递送程序，但未定量评估每只动物的转导效率。研究结论部分翻译：尽管存在这些局限性，研究人员的发现提供了功能证据，支持AIRE在mESC向TEP分化中的作用及其与胸腺免疫耐受和T1D进展的关联。