《International Journal of Molecular Sciences》：Changes in Connexin-43 Expression and Neuropil Ultrastructure in the Cerebral Cortex of Bats During the Sleep–Wake Cycle
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睡眠维持着中枢神经系统的稳态，但睡眠-觉醒调控的许多分子机制仍知之甚少。Connexin-43（Cx43），即星形胶质细胞间隙连接蛋白，支持神经胶质通讯，但其在生理性睡眠中的作用研究甚少。在本研究中，研究人员利用共聚焦显微镜、透射电子显微镜、半自动化图像分析和
睡眠维持着中枢神经系统的稳态，但睡眠-觉醒调控的许多分子机制仍知之甚少。Connexin-43（Cx43），即星形胶质细胞间隙连接蛋白，支持神经胶质通讯，但其在生理性睡眠中的作用研究甚少。在本研究中，研究人员利用共聚焦显微镜、透射电子显微镜、半自动化图像分析和分子动力学模拟，分析了普通夜蝠（Nyctalus noctula）运动皮层在睡眠和觉醒期间Cx43的表达、间隙连接组织和神经毡超微结构。与觉醒相比，睡眠与更高的Cx43免疫反应性以及更多、更大的星形胶质细胞间隙连接斑块相关。在整个神经毡视野中，突触、突起和线粒体的计数以及总活性带长度在觉醒期间更高，而平均线粒体轮廓在睡眠期间更大；在对动物内数据进行平均后，仅总活性带长度在觉醒期间仍然显著更高。在觉醒期间，更多的突触周星形细胞突起（PAP）轮廓接触突触，而单个PAP在睡眠期间更大；这两个对比在动物水平平均后仍然显著。作为一项次要的、假设生成的辅助分析，研究人员模拟了Cx43半通道的组织酸质子化，作为酸性条件的简化模型。未测量脑部pH值，且该模拟不能解释睡眠相关的Cx43增加。在计算机模拟中，质子化降低了构象灵活性，并缩小了中央和细胞外孔道区域。
蝙蝠睡眠-觉醒周期中大脑皮层Cx43表达与神经毡超微结构变化的综合解读
研究背景与研究动机
睡眠是维持中枢神经系统正常功能所必需的基本生理过程之一，尤其在恢复和维持稳态方面至关重要。然而，尽管睡眠研究取得了显著进展，其背后的分子和细胞机制仍有许多未解之谜。星形胶质细胞及其形成的间隙连接在维持睡眠期间的神经胶质稳态中扮演关键角色。Connexin-43（Cx43）是星形胶质细胞间隙连接的主要结构蛋白，它对于形成星形胶质细胞合胞体至关重要，该合胞体介导空间钾缓冲、代谢物细胞间运输等多种稳态过程。Cx43表达或定位的改变可能严重影响神经胶质稳态，进而影响睡眠-觉醒周期。已有研究表明，Cx43表达失调会导致小鼠睡眠结构和觉醒维持的紊乱，但其在生理性睡眠调控中的具体作用仍不完全清楚。
另一方面，突触活动是睡眠调控的另一个关键决定因素。根据突触稳态假说，突触强度在觉醒期间因持续与环境互动而逐渐增强，而睡眠则通过降低突触强度、大小和/或密度来促进突触正常化，防止突触饱和。这一概念已在多种啮齿类动物实验中得到支持，但在蝙蝠这类具有独特生理适应性的动物模型中，相关研究几乎空白。蝙蝠以其倒挂睡眠姿势、回声定位、超高代谢率和长每日睡眠时长等特性，成为研究睡眠-觉醒周期细胞和分子机制的理想模型。然而，针对蝙蝠在不同生理状态下皮层神经毡超微结构的定量形态学研究，尤其是同时考察Cx43表达和神经毡超微结构参数的研究，此前尚未开展。
因此，本研究旨在首次比较普通夜蝠（Nyctalus noctula）在觉醒和睡眠状态下，其运动皮层中Cx43的表达差异以及皮层神经毡的超微结构特征。此外，鉴于蝙蝠独特的倒挂姿势可能引起酸碱平衡变化，研究人员还进行了探索性的计算机模拟，以评估酸性条件下Cx43半通道的结构行为，尽管并未实际测量脑部pH值。
关键技术方法概述
为完成上述研究目标，研究人员采用了一套多模态的技术组合：
- 1.
共聚焦激光扫描显微镜：用于对Cx43进行免疫荧光标记，并结合三维重建技术，定量分析不同生理状态下Cx43的荧光强度。
- 2.
透射电子显微镜：用于在纳米尺度下观察和分析皮层神经毡的超微结构，包括突触、神经元突起、线粒体和突触周星形细胞突起（PAPs）的形态学参数。
- 3.
半自动化图像分析与深度学习：利用基于DINO-SwinL架构的目标检测模型，对共聚焦图像中的Cx43阳性间隙连接斑块进行自动识别和计数，并由盲法标注人员进行人工校正以提高准确性。所有动物均为野外捕获的成年雄性普通夜蝠，样本来源于俄罗斯顿河畔罗斯托夫附近。
- 4.
分子动力学模拟：使用GROMACS软件包，对Cx43半通道六聚体在生理状态和特定组氨酸质子化状态下的构象变化进行模拟分析，探究酸性条件对通道孔径和柔韧性的潜在影响。
主要研究发现
2.1. 三维重建与Cx43表达的定量分析
通过共聚焦显微镜和三维重建发现，睡眠状态下的Cx43免疫反应性显著高于觉醒状态。定量分析证实，睡眠组的平均Cx43荧光强度约为觉醒组的2.5倍，差异具有统计学意义。
2.2. 电镜图像的形态计量学分析
透射电镜结合定量分析揭示了神经毡超微结构的显著差异。在视野水平上，觉醒期与更高的突触数量、突触区数量、总活性带长度、神经元突起数量和总面积以及线粒体数量相关；而睡眠期则与更大的平均线粒体面积相关。在动物水平平均并进行多重比较校正后，只有总活性带长度在觉醒期仍保持显著增高。这支持了突触稳态假说，即觉醒期突触负载更高。
2.3. 突触周星形细胞突起（PAPs）的分析
进一步分析表明，觉醒期有更多PAP轮廓接触突触，而睡眠期的单个PAP面积和周长显著更大。总PAP面积在两种状态下无显著差异，这表明发生了形态重塑而非总体覆盖率的改变。这种变化模式与Cx43表达的增加相反，提示两者可能是星形胶质细胞在睡眠-觉醒周期中重塑的不同组成部分。
2.4. 分子动力学模拟分析
对Cx43半通道的模拟显示，组氨酸质子化导致通道构象发生显著变化。与生理状态相比，质子化后的半通道构象灵活性降低，整体结构更紧凑，其中央和细胞外孔道区域的直径减小。这暗示酸性环境可能限制离子通过Cx43半通道的通透性，但该模拟结果独立于组织学发现，不解释睡眠相关的Cx43表达升高。
讨论与结论总结
本研究的讨论部分指出，睡眠期Cx43免疫反应性和间隙连接斑块的增加，与增强的星形胶质细胞耦合作用相符，这可能有助于支持离子缓冲、代谢转移和类淋巴清除等功能。而觉醒期更高的总活性带长度和较低的Cx43免疫反应性，则与较高的突触负荷和能量需求模式一致。PAPs的形态变化和Cx43表达的反向关系，提示它们代表了星形胶质细胞在睡眠-觉醒周期中不同的、但可能相互关联的重塑过程。线粒体在觉醒期数量多、个体小，在睡眠期数量少、个体大的变化，反映了线粒体裂变与融合的动态调节，以适应不同脑功能状态下的能量需求。
研究结论总结如下：睡眠期Cx43阳性斑块数量和尺寸的增加，与星形胶质细胞合胞体内更强的耦合以及更强的离子缓冲和代谢支持能力相一致。相比之下，觉醒期则以动物水平平均后更高的总活性带长度为标志，同时伴随其他突触计数呈相同趋势和更低的Cx43免疫反应性——这是一种与高突触负荷和能量需求相符的模式。分子动力学结果表明，组氨酸质子化可以缩小半通道孔道并降低构象灵活性，这与已知的Cx43 pH依赖性门控机制一致。然而，该计算观察结果与组织学发现是分离的：未测量脑部pH值，且质子化并不能解释睡眠相关的Cx43信号升高。总体而言，这些数据描述了蝙蝠运动皮层在觉醒和睡眠之间协调的、状态相关的差异，提示了一个从高突触需求状态向更具耦合性、可能更具修复性的胶质状态的合理转变，但并未建立睡眠调控的因果机制。
