基于虚拟筛选与体外实验整合策略的新型靶向微管蛋白杂环化合物鉴定研究

《Pharmaceuticals》：Identification of Novel Potential Tubulin-Targeting Heterocyclic Compounds via Integrated Virtual Screening and In Vitro Studies

　　

背景：开发新型靶向微管蛋白（tubulin）的药物仍是抗癌药物设计中颇具前景的策略。本研究通过整合计算机模拟（in silico）与体外（in vitro）工作流程，鉴定出新型杂环类微管蛋白靶向化合物。方法：研究人员对约8000个结构多样的内部杂环化合物库进行了抗增殖活性筛选，获得260个经实验验证的有效化合物（hits）。这些化合物分别对接至微管蛋白的秋水仙碱（colchicine）、长春碱（vinca）和紫杉烷（taxane）结合位点。此外，部分化合物在Jurkat细胞中检测了其对细胞β-微管蛋白（β-tubulin）蛋白水平的影响。结果：对接分析显示，42个化合物的结合能等于或优于秋水仙碱，3个化合物与长春碱（vinblastine）相当，18个化合物超过紫杉醇（paclitaxel），提示秋水仙碱位点和紫杉烷位点为优先靶点。5个评分最高的化合物（Les-6370、Les-4272、Les-4309、Les-4403和Les-1419）经分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟进一步分析，确认其结合稳定，尤其在秋水仙碱位点，并具有有利的氢键和疏水相互作用。在10 μM浓度下，Les-1419和Les-4309相对于参比化合物康普瑞汀A-4（Combretastatin A-4），分别使Jurkat细胞总细胞β-微管蛋白水平降低57.73%和54.31%。结论：本研究鉴定出具有良好微管蛋白相互作用活性和预测类药性质的新型起始骨架，代表了结构新颖的母体结构，为进一步结构优化和类似物开发提供了有前景的起点。

论文解读：整合虚拟筛选与体外研究鉴定新型微管蛋白靶向杂环化合物

一、研究背景与问题

微管（microtubules）是由α-和β-微管蛋白异二聚体组装而成的动态细胞骨架结构，具有聚合与解聚能力。其特性源于与多种调节蛋白的相互作用，这些蛋白调控微管动力学和组织，进而影响细胞分裂、运动、极性及胞内运输等关键生命过程。因此，微管蛋白被视为抗癌药物开发的重要靶点。微管蛋白包含多个结合位点，主要位于β-微管蛋白亚基上，参与微管动力学的调控。天然产物如秋水仙碱、长春碱类生物碱和紫杉醇等结合于这些位点，抑制微管聚合，导致细胞周期阻滞和凋亡。

尽管现有微管蛋白靶向药物取得了一定治疗成功，但其临床应用面临多重限制。首要挑战是耐药性的产生，这降低了癌症治疗的长期疗效。已确立的微管蛋白靶向药物的临床应用还受限于剂量依赖性毒性，尤其是神经毒性、肿瘤选择性不足以及耐药性发展。主要耐药机制包括ATP结合盒转运蛋白介导的药物外排增加、β-微管蛋白亚型表达改变、微管蛋白突变以及微管动力学变化。此外，系统性毒性也是重要问题，许多化合物不仅影响癌细胞，也损害健康组织。现有抑制剂特异性不足常导致不良副作用，包括神经毒性和骨髓抑制。同时，现有化合物的化学多样性有限，制约了对替代结合模式和机制的探索。发现新的化学骨架可能为克服耐药和增强药理学特性提供机会。

近年来，微管蛋白靶向药物的研究越来越多地采用整合计算机模拟与体外方法，以鉴定和表征具有潜在抗微管蛋白活性的新型化学型。分子对接和虚拟筛选等计算化学工具能够快速优先筛选对关键微管蛋白结合位点具有潜在亲和力的化合物，显著降低早期药物发现的时间和成本。然而，计算预测需要实验验证以确认生物学相关性。基于细胞的抗增殖实验提供了癌细胞系中细胞毒性效应的必要确认。整合计算筛选与体外验证可减少假阳性命中，支持合理的先导化合物选择。

二、研究设计与关键方法

研究人员基于约8000个结构多样的内部杂环化合物库，经国家癌症研究所（NCI，美国）NCI-60人肿瘤细胞系筛选及内部MTT细胞毒性实验，鉴定出260个体外验证的抗癌活性化合物。这些化合物随后进行分子对接（AutoDock Vina 1.1.2），针对秋水仙碱（PDB 4O2B）、长春碱（PDB 5J2T）和紫杉烷（PDB 1JFF）三个结合位点。对接验证通过重新对接天然配体实现，RMSD值均低于2 ?。评分最高的5个化合物进一步经100 ns分子动力学模拟（GROMACS，OPLS-AA力场）评估结合稳定性。ADMET和类药性通过SwissADME和ProTox 3.0预测。化合物对肿瘤及非肿瘤细胞系的细胞毒性采用MTT法测定，β-微管蛋白水平采用ELISA定量。

三、研究结果

3.1 分子对接研究

260个测试化合物中，42个与微管蛋白的结合能等于或低于秋水仙碱（秋水仙碱位点结合能范围：?2.4至?12.3 kcal/mol）；仅3个化合物在长春碱位点表现出与长春碱相当或略优的结合能（范围：?5.4至?11.7 kcal/mol）；18个化合物在紫杉烷位点的对接评分高于紫杉醇（范围：?5.1至?11.1 kcal/mol）。这表明秋水仙碱和紫杉烷位点是所筛杂环实体最优先的靶点。基于对接分析，优先选择5个化合物（Les-6370、Les-4272、Les-4309、Les-4403和Les-1419）进行进一步研究。对接姿态分析显示，Les-4309和Les-1419占据α-和β-微管蛋白界面的秋水仙碱结合口袋，主要通过疏水接触和多个氢键稳定。Les-6370在长春碱位点表现出最高结合能，主要通过疏水相互作用结合。在紫杉烷位点，相互作用以疏水作用为主，与紫杉醇的结合模式相似。

3.2 分子动力学分析

秋水仙碱位点100 ns MD模拟中，所有化合物RMSD均未超过0.3 nm，表明复合物总体稳定。Les-4403的RMSD随时间稳步下降，至模拟结束时低于0.1 nm，接近康普瑞汀A-4的有限结构偏差，且在整个模拟中维持最多氢键数，支持形成更稳定的配体-微管蛋白复合物。紫杉烷位点模拟中，Les-4403结构偏差最大（RMSD超过0.3 nm），而Les-1419和Les-6370形成最稳定的复合物，RMSD最低且无显著波动。Les-1419在整个模拟中维持稳定的氢键数，最多可达4个。Rg分析表明所有复合物均保持结构紧凑性。总体而言，所研究化合物在秋水仙碱位点形成的复合物显著更稳定，表现为更低的RMSD和更多氢键；紫杉烷位点复合物稳定性普遍较低，但Les-1419-微管蛋白复合物除外。

3.3 ADMET与类药性评估

SwissADME预测显示，Les-6370和Les-4403因高分子量和/或亲脂性，可能存在Lipinski五规则依从性限制，且溶解度较低；Les-6370毒性特征最不利。相比之下，Les-4309、Les-4272和Les-1419表现出令人满意的类药性，ADMET特征无显著违反。预测LD₅₀范围为500至1700 mg/kg，所有化合物归为毒性4类。

3.4 合成与表征

Les-4272、Les-4309、Les-4403和Les-6370为首次报道的新化合物，其合成基于吡唑啉（pyrazoline）结构单元。Les-1419的合成已有文献报道。所有化合物结构经¹H和¹³C NMR及LC-MS确认。

3.5 体外细胞毒性评价

Les-1419在多种癌细胞系（乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231，结直肠癌HT-29、DLD-1，胃癌AGS，白血病Jurkat、RPMI-8866、K562）中表现出最高细胞毒性活性，IC₅₀值为4.3–18.3 μM（48–72 h）。Jurkat细胞敏感性最高。Les-4403对RPMI-8866细胞具有选择性毒性（IC₅₀ 5.4 μM，72 h）。Les-1419和Les-4309在48 h处理下对Jurkat细胞活性显著（IC₅₀分别为4.9和3.6 μM）。Les-6370在大多数细胞系中无活性（IC₅₀ > 20 μM）。选择性指数（selectivity index, SI）计算显示，Les-4309和Les-4272对Jurkat细胞具有选择性（SI分别为8.7和10.0），Les-4403对RPMI-8866细胞具有选择性（SI = 9.3）。

3.6 β-微管蛋白浓度ELISA评估

在Jurkat细胞中，10 μM浓度下Les-1419使β-微管蛋白浓度较对照组降低57.73%（679.7 ± 105.6 pg/mL vs 1608.0 ± 109.9 pg/mL），5 μM时降低48.94%，1 μM时降低35.32%，均具有统计学显著性，呈明显剂量-反应关系。Les-4309仅在最高测试浓度10 μM时表现出统计学显著效果，降低54.31%（734.7 ± 91.78 pg/mL）。这可能提示Les-4309除β-微管蛋白抑制外，还存在其他抗癌机制，其结构中吡唑啉和苯并噁唑片段均已知具有多种非微管蛋白相关的抗癌机制。

3.7 结构新颖性与初步构效关系分析

Reaxys数据库检索未发现将这些结构与微管蛋白抑制相关联的文献报道。SwissTargetPrediction平台未显示Les-1419和Les-4309与已知微管蛋白配体有显著相似性，预测概率值较低。然而，这类配体相似性工具存在固有偏倚，倾向于已充分探索的化学空间区域，因此阴性结果应谨慎解读。初步构效关系分析显示，二芳基吡唑啉骨架是反复出现的结构基序，18个虚拟命中中有13个属于该化学型。本研究系列代表新型化学型，具有独特结构特征：Les-1419为二芳基吡唑啉核心直接连接至噻唑烷环C4位的新型连接杂合体；Les-4272和Les-6370采用亚甲基羰基连接子；Les-4403和Les-4309采用硫代亚甲基羰基桥。

四、结论

通过整合计算机模拟与体外策略，研究人员从约8000个分子库中高效鉴定了具有微管蛋白抑制活性和良好预测类药性质的杂环命中化合物。秋水仙碱和紫杉烷结合位点被确认为最相关靶点。命中化合物Les-1419和Les-4309在Jurkat细胞中表现出强效β-微管蛋白抑制，支持其生物学相关性和抗癌潜力。这些骨架的结构新颖性扩展了微管蛋白靶向化合物的化学空间，为合理命中优化提供了独特机会。该研究验证了所应用方法作为命中鉴定稳健工具的价值，并为设计具有增强效力、选择性和药代动力学特征的类似物奠定了坚实基础。