铁蛋白重链1（FTH1）通过抑制Erastin诱导的铁死亡维持绵羊颗粒细胞的类固醇激素合成

《Biomolecules》：Ferritin Heavy Chain 1 Sustains Steroid Hormone Synthesis in Sheep Granulosa Cells by Suppressing Erastin-Induced Ferroptosis

　　

摘要：产羔数是决定绵羊生产经济效益的关键性状。铁蛋白重链1（ferritin heavy chain 1，FTH1）作为一种关键的储铁蛋白，在调节细胞对铁死亡（ferroptosis）的易感性中发挥重要作用。基于研究人员先前观察到单羔与多羔湖羊卵巢中铁死亡相关通路存在差异，本研究探讨了FTH1在调控绵羊颗粒细胞（granulosa cells，GCs）铁死亡及细胞功能中的作用。采用RT-qPCR检测不同繁殖表型及卵泡发育阶段的湖羊卵巢组织和GCs中FTH1的表达。在绵羊GCs中建立了Erastin诱导的铁死亡模型，并通过过表达和干扰实验评估FTH1的功能。分析了铁死亡相关指标，包括活性氧（ROS）、C11-BODIPY 581/591、亚铁离子（Fe2+）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、铁死亡相关基因及GPX4蛋白表达。通过检测STAR、CYP11A1、HSD17B1和3β-HSD的表达以及雌二醇（E2）和孕酮（P4）分泌水平评估类固醇生成功能。对经Erastin处理的GCs中FTH1过表达相关的转录组变化进行RNA测序。结果表明，FTH1在多胎绵羊卵巢及健康卵泡中表达更高。FTH1过表达通过增强GPX4表达、减少Fe2+积累、降低ROS产生和脂质过氧化，减轻了Erastin诱导的铁死亡，而FTH1敲低则加剧了铁死亡损伤。此外，在铁死亡胁迫下，FTH1通过促进STAR表达并维持E2和P4的合成来维持类固醇生成功能。Ferrostatin-1（Fer-1）可部分恢复GC活力和类固醇生成能力，并减弱Erastin诱导的细胞凋亡。在Erastin处理下，转录组分析在FTH1过表达的GCs与相应载体对照组之间鉴定出297个差异表达mRNA和92个lncRNA。这些差异表达转录本代表了需要进一步功能验证的候选调控关系。富集分析突出了细胞因子信号和ROS相关通路，提示了FTH1在这些条件下发挥作用的相关潜在过程。总之，这些发现支持FTH1保护绵羊GCs免受铁死亡诱导的损伤并维持类固醇生成功能，为铁稳态在卵泡发育中的作用提供了新的见解。

一、研究背景与科学问题

在肉羊生产中，卵泡发育直接决定排卵能力和产羔数，是影响繁殖性能的核心因素。卵泡闭锁是哺乳动物卵巢中的一种生理过程，有助于维持卵巢微环境稳态并清除发育潜能较差的卵泡，但过度闭锁会减少可用排卵卵泡池，损害母羊的繁殖性能。颗粒细胞（GCs）是支持卵泡生长、卵母细胞成熟和内分泌功能的主要体细胞，其增殖与分化是卵泡发育的关键环节。GCs通过缝隙连接为卵母细胞提供营养和旁分泌支持，响应促性腺激素刺激，并合成雌二醇（E₂）和孕酮（P₄）等类固醇激素。卵巢类固醇生成依赖于一系列酶促反应：类固醇生成急性调节蛋白（STAR）介导胆固醇从线粒体外膜向内膜转运，这是限速步骤；细胞色素P450家族11亚家族A成员1（CYP11A1）将胆固醇裂解为孕烯醇酮；3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）催化孕烯醇酮转化为P₄；下游雌激素途径中，17β-羟基类固醇脱氢酶1型（HSD17B1）将低活性的雌酮还原为生物活性的E₂。

GC死亡失调是卵泡闭锁的核心事件。长期以来，细胞凋亡被认为是此过程中GC丢失的主要方式。近期在哺乳动物和禽类卵泡中的研究将铁积累、抗氧化防御受损和脂质过氧化与GC功能障碍及卵泡闭锁联系起来。然而，铁死亡在闭锁过程中的确切角色仍未明确。许多铁死亡相关变化与闭锁卵泡更广泛的氧化衰退重叠，难以判断铁死亡是启动卵泡退化、与凋亡平行发生，还是作为细胞损伤的继发后果。铁死亡与凋亡之间的时间及功能关系也不清楚。在绵羊中，将铁死亡调节因子与GC存活及内分泌功能联系起来的直接证据仍然有限。

铁死亡是一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的新型调节性细胞死亡形式。其核心机制依赖于亚铁离子（Fe²⁺）通过芬顿反应产生有害自由基。铁蛋白重链1（FTH1）是铁蛋白的核心组分，在铁储存和铁死亡控制中发挥关键作用。研究人员前期的单细胞转录组研究发现，不同产羔数的湖羊卵巢中铁死亡相关通路存在差异，并指出FTH1是与GC功能相关的候选基因。然而，改变FTH1表达是否会改变绵羊GCs对铁死亡相关损伤的易感性，以及这种反应是否伴随类固醇激素产生的维持，尚不清楚。因此，本研究旨在探究FTH1在限制Erastin诱导的绵羊GCs铁和氧化损伤中的作用，从而帮助维持其活力和内分泌功能。

二、主要关键技术方法

1. 1.
   样本来源与细胞模型：收集来自屠宰场的非妊娠母羊（年龄1-2岁）的100个卵巢，分离并培养原代绵羊颗粒细胞（GCs）。同时使用了前期研究中不同产羔数（单羔和多羔）湖羊的卵巢组织样本。
2. 2.
   基因操作：构建绵羊FTH1编码序列的全长过表达质粒（oe-FTH1）及特异性小于扰RNA（si-FTH1），利用脂质体转染法在GCs中进行过表达和干扰。
3. 3.
   铁死亡模型建立与干预：使用Erastin（一种系统xc^-抑制剂）诱导GCs铁死亡，并应用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）进行挽救实验。
4. 4.
   表型与功能检测：通过流式细胞术检测细胞凋亡；RT-qPCR和蛋白质印迹法检测基因和蛋白表达；CCK-8法检测细胞活力；荧光探针（DCFH-DA和C11-BODIPY 581/591）检测ROS和脂质过氧化；比色法检测Fe²⁺、总铁、MDA和GSH含量；ELISA检测E₂和P₄浓度。
5. 5.
   转录组学分析：对Erastin处理后FTH1过表达的GCs进行RNA测序（RNA-seq），鉴定差异表达mRNA和lncRNA，并进行KEGG富集分析和共表达网络构建。

三、研究结果

3.1. FTH1在湖羊组织中的表达

通过RT-qPCR检测发现，FTH1在多羔组湖羊卵巢组织中的表达显著高于单羔组。在分离的GCs中，大卵泡（>4.5mm）的FTH1表达高于小卵泡（<3.0mm），且健康卵泡GCs中的FTH1表达显著高于闭锁卵泡。这为进一步研究FTH1在GCs中的生物学功能提供了依据。

3.2. Erastin浓度筛选

研究人员用不同浓度Erastin处理GCs 24小时。结果显示，10μM Erastin引起生化应激但不显著降低细胞活力，而20μM导致更严重的铁死亡相关损伤、活力下降和氧化损伤增加。因此，后续实验选用10μM代表轻度铁死亡胁迫，20μM代表更严重的氧化损伤。

3.3. FTH1对GCs铁死亡的影响

通过过表达和干扰实验证实，FTH1过表达可上调GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）表达，下调ACSL4（酰基辅酶A合成酶长链家族成员4）和NCOA4（核受体共激活因子4）表达，显著降低ROS强度、MDA含量和Fe²⁺积累，并增加GSH水平，从而减轻Erastin诱导的铁死亡。相反，FTH1敲低则下调GPX4和SLC7A11（溶质载体家族7成员11）表达，上调ACSL4表达，加剧了铁死亡损伤。这些结果表明FTH1通过增强抗氧化防御和限制铁积累来保护GCs免受铁死亡。

3.4. FTH1对GCs类固醇生成功能的影响

在无Erastin处理时，FTH1过表达对激素合成相关基因表达及E₂和P₄水平无显著影响，而敲低则降低了3β-HSD mRNA水平和激素合成。在Erastin胁迫下，FTH1过表达显著上调了STAR和CYP11A1的表达，并增加了E₂和P₄的分泌。FTH1敲低则进一步抑制了STAR、CYP11A1、HSD17B1和3β-HSD的表达，并减少了激素分泌。这表明FTH1通过在铁死亡胁迫下保护类固醇生成机制来维持GC的内分泌功能。

3.5. Fer-1缓解Erastin诱导的功能损伤和凋亡相关变化

与单独使用Erastin相比，联合使用铁死亡抑制剂Fer-1能显著恢复GC活力，上调GPX4并下调ACSL4表达，增加类固醇生成标志物（CYP11A1、STAR、3β-HSD）的表达及E₂和P₄的分泌。此外，Fer-1还显著降低了Erastin引起的凋亡细胞百分比和CASP3（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3）的表达。这表明抑制铁死亡可以减轻与之相关的凋亡损伤，并改善GC功能。

3.6. 探索性RNA-seq分析鉴定FTH1相关的转录组变化

对10μM Erastin处理下的FTH1过表达和对照GCs进行转录组测序，鉴定出297个差异表达mRNA和92个差异表达lncRNA。KEGG富集分析显示，上调基因富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、内质网蛋白加工和JAK-STAT信号通路；下调基因富集于氧化磷酸化通路。此外，一些参与谷胱甘肽代谢和铁处理的基因（如GSS、TFR1、PCBP1/2、STEAP3、ZIP8/14）在FTH1过表达细胞中上调。通过Pearson相关性分析，构建了候选lncRNA-mRNA调控网络，并识别出多个与FTH1表达强相关的lncRNA，提示存在潜在的转录后调控层。

四、讨论与结论总结

讨论部分：本研究通过功能验证，明确了FTH1在原代绵羊GCs中的保护作用。FTH1在健康和大卵泡中高表达，并通过其储铁功能（氧化Fe²⁺并将其隔离于铁蛋白中）限制不稳定铁池，减少芬顿反应驱动的ROS产生，从而减轻Erastin诱导的铁死亡。这种保护效应在不同胁迫强度下表现不同，反映了铁死亡应激的不同阶段和调控水平。重要的是，研究首次将FTH1介导的铁死亡控制与GC的类固醇生成功能联系起来。FTH1过表达并非直接刺激基础激素产生，而是在铁死亡胁迫下通过保护线粒体类固醇生成步骤（特别是STAR-CYP11A1轴）和减少氧化损伤，来维持E₂和P₄的合成。此外，Fer-1挽救实验表明，铁死亡胁迫与凋亡损伤相关联，抑制铁死亡可同时减轻氧化损伤和凋亡指数，提示这两种细胞死亡形式在卵泡闭锁中存在交互作用。转录组分析揭示了FTH1过表达后与细胞因子信号、ROS相关通路及非编码RNA调控网络的关联，为理解其保护机制提供了新线索。

结论：综上所述，本研究证实FTH1能够保护绵羊颗粒细胞免受铁死亡诱导的损伤，并在铁死亡胁迫下维持其类固醇生成功能。这些发现为理解铁稳态在卵泡发育中的作用提供了新的见解。