《Biomolecules》：Carbon Monoxide Generation, Heme Turnover, and Lipid Peroxidation During Heme-Mediated LDL Oxidation: Association of HO-1, Hemopexin, and A1M with LDL
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血红素促进低密度脂蛋白（LDL）的氧化修饰，该过程与动脉粥样硬化密切相关。然而，血红素在LDL氧化过程中的命运及其降解调控机制仍知之甚少。研究人员研究了血红素/H2O2诱导的LDL氧化过程中的血红素分解代谢，并鉴定了可能参与该过程的LDL相关蛋白。研究评估了脂
血红素促进低密度脂蛋白（LDL）的氧化修饰，该过程与动脉粥样硬化密切相关。然而，血红素在LDL氧化过程中的命运及其降解调控机制仍知之甚少。研究人员研究了血红素/H2O2诱导的LDL氧化过程中的血红素分解代谢，并鉴定了可能参与该过程的LDL相关蛋白。研究评估了脂质过氧化、血红素Soret吸收以及一氧化碳（CO）的产生。血红素诱导了脂质过氧化、Soret信号丢失及CO生成，而CuSO4介导的氧化仅诱导脂质过氧化而未检测到CO，支持CO产生与血红素依赖性氧化的关联。靶向及数据非依赖性蛋白质组学和免疫学分析在LDL中鉴定了血红素加氧酶-1（HO-1）、Hemopexin（HPX）和α-1-微球蛋白（A1M）。HO-1抑制降低了CO产生并延迟了早期血红素丢失和脂质过氧化，尽管这些效应随时间减弱。DTPA同样延迟了早期血红素丢失和脂质过氧化并减少了CO产生，而BHT强烈抑制脂质过氧化、保留血红素Soret信号并在整个氧化过程中减少CO产生。HPX减弱了血红素诱导的LDL氧化和CO生成。这些发现表明，HO-1相关的铁释放与CO生成共同促进了血红素介导的LDL氧化的早期阶段，且未释放的血红素结合铁同样参与LDL的氧化修饰。
论文解读
一、研究背景与科学问题
心血管疾病是全球范围内导致死亡的首要原因，动脉粥样硬化是其主要的潜在病理过程。动脉粥样硬化的发生和进展与氧化应激及动脉壁内氧化修饰脂蛋白的积累密切相关。其中，低密度脂蛋白（LDL）发挥核心作用，因为LDL的氧化修饰增强了巨噬细胞对其的摄取，促进泡沫细胞形成，并触发炎症反应，从而促进斑块的发展和进展。
游离血红素是一种强效促氧化剂，在血管内溶血、组织损伤和血红蛋白降解过程中释放。由于其氧化还原活性的铁，血红素可以催化氧化反应，促进脂质过氧化和生物分子的氧化修饰。血红素诱导的LDL氧化已被认为与血管功能障碍和动脉粥样硬化进展有关。尽管血红素介导的脂质过氧化已被充分记录，但活性氧、脂质衍生自由基和内源性抗氧化系统对LDL氧化的相对贡献仍未完全阐明。
血红素加氧酶-1（HO-1）是负责血红素降解的可诱导限速酶，产生胆绿素、一氧化碳（CO）和二价铁。HO-1的诱导通常被认为是针对氧化应激的细胞保护反应，因为它限制游离血红素的积累，同时产生具有抗氧化、抗炎和细胞保护特性的代谢产物。然而，HO-1是否直接限制血红素诱导的LDL氧化，或者LDL相关蛋白是否参与细胞外血红素代谢，仍不清楚。
LDL颗粒含有除载脂蛋白B-100（APOB-100）之外的众多蛋白质。这些蛋白质被认为影响脂质代谢、炎症、氧化过程和脂蛋白功能。然而，直接参与血红素代谢的蛋白质与LDL的关联很少受到关注，它们对血红素诱导的LDL氧化修饰的潜在调控作用仍然未知。
基于上述背景，本研究旨在：第一，探究HO-1在血红素诱导的LDL脂质过氧化中的作用；第二，检查LDL的蛋白质组成，特别关注参与血红素代谢的蛋白质；第三，阐明血红素在LDL氧化过程中的命运及其降解机制。
二、研究内容与主要结论
研究人员发现，血红素与H2O2协同作用可显著促进LDL脂质氧化，表现为共轭二烯形成增加，而单独的血红素或H2O2均不能诱导脂质氧化。与此同时，Soret带的进行性下降表明血红素在反应过程中被逐步降解。相比之下，CuSO4介导的LDL氧化虽然最终产生了相当程度的硫代巴比妥酸反应物质（TBARs），但其效应相对于血红素/H2O2系统有所延迟，且不伴随CO的产生。
研究还发现，HO-1抑制剂HO-1-IN可显著降低CO生成，并在早期时间点（45分钟）延缓血红素降解和脂质过氧化，但这种抑制效应随时间推移而减弱。铁螯合剂DTPA同样延迟了早期血红素降解和脂质过氧化并减少了CO产生，但未能完全阻止氧化进程。而自由基清除剂BHT则在整个孵育期间强烈抑制脂质过氧化、保留血红素Soret信号并减少CO产生。
通过靶向平行反应监测（PRM）蛋白质组学、数据非依赖性采集（DIA）蛋白质组学、免疫印迹和免疫荧光分析，研究人员首次证实了HO-1和α-1-微球蛋白（A1M）存在于LDL颗粒中，并鉴定了包括触珠蛋白、Hemopexin（HPX）和A1M在内的多种血红素结合蛋白。功能实验表明，Hemopexin可显著抑制血红素依赖的CO生成和LDL氧化，A1M同样可减弱血红素诱导的LDL氧化。
这些发现表明，HO-1相关的铁释放与CO生成共同促进了血红素介导的LDL氧化的早期阶段，而未释放的血红素结合铁同样参与LDL的氧化修饰。LDL相关血红素分解代谢也可能通过HO-1非依赖机制发生。
三、主要关键技术方法
本研究从三位健康志愿者的EDTA抗凝静脉血中分离血浆，采用梯度超速离心法提取天然LDL（nLDL），使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。研究采用了以下关键技术方法：紫外-可见光谱法监测Soret带405 nm吸光度以评估血红素降解；气相色谱法（GC-2010，Shimadzu）定量顶空气体中CO浓度；基于平行反应监测（PRM）的靶向蛋白质组学，使用Easy-nLC 1200纳升液相系统联用Orbitrap Fusion质谱仪，针对HO-1的两个蛋白特征肽段（TEPELLVAHAYTR和VQDSAPVETPR）进行检测；数据非依赖性采集（DIA）蛋白质组学，使用DIA-NN（v2.2）以文库自由搜索模式处理数据，人类蛋白序列FASTA数据库（20,420条经审核条目）下载自UniProtKB；免疫印迹法检测HO-1和A1M；A1M酶联免疫吸附测定（ELISA）；免疫荧光染色使用Leica Lightning超分辨显微镜成像。所有数据以三位独立供体的平均值±标准误表示，采用t检验进行统计分析，p<0.05为差异有统计学意义。
四、研究结果
3.1 血红素促进LDL氧化修饰过程中的CO形成
LDL单独孵育或与血红素、H2O2分别单独孵育时均未检测到CO释放。而血红素与H2O2共同孵育后，CO产生显著增加。共轭二烯形成和TBARs水平在所有时间点均显著升高，同时Soret带吸光度随时间进行性下降。7天长期孵育实验中，血红素同样显著增加CO产生、共轭二烯和TBARs形成。
3.2 CuSO4介导的LDL氧化不产生CO
CuSO4处理60分钟和7天后均未检测到CO释放，但显著增加了共轭二烯和TBARs形成，且7天后的氧化程度超过血红素诱导的水平，证实了在无CO产生的情况下LDL发生了广泛氧化。
3.3 HO-1抑制减少CO形成并延迟血红素降解和脂质过氧化
HO-1-IN（20 μM）显著降低了60分钟时nLDL/血红素/H2O2产生的CO（约40 ppm降至约10 ppm）。在45分钟时，HO-1-IN保留了Soret带强度并显著减少了共轭二烯和TBARs形成，但到90和180分钟时，这些指标与未处理组相当或略低，表明抑制效应随时间减弱。
3.4 铁螯合减少CO形成并延迟血红素降解和脂质过氧化
DTPA（80 μM）显著降低了CO产生（约40 ppm降至约30 ppm），在45和90分钟时显著延缓了Soret带下降和共轭二烯形成，并降低了TBARs水平，但到180分钟时差异不再显著，表明铁螯合延迟而非阻止了脂质过氧化。
3.5 BHT阻止CO形成并抑制血红素降解和脂质过氧化
BHT（10 μM）完全阻止了CO产生，在整个180分钟孵育期间显著保留了Soret带强度，并在所有时间点显著抑制了共轭二烯和TBARs形成，表明抑制脂质过氧化与血红素保留和CO减少密切相关。
3.6 LDL制剂中HO-1和血红素结合蛋白的鉴定
PRM靶向蛋白质组学确认了HO-1的两个蛋白特征肽段TEPELLVAHAYTR（位于血红素结合口袋附近）和VQDSAPVETPR（位于C端柔性环）存在于LDL制剂中。DIA蛋白质组学在LDL样本中鉴定了72种蛋白质（至少两个胰蛋白酶肽段），其中触珠蛋白、Hemopexin和A1M被鉴定为血红素结合蛋白。免疫印迹在三位供体的LDL制剂中均检测到HO-1免疫反应性，免疫荧光染色进一步证实了该发现。
3.7 Hemopexin抑制血红素依赖的CO生成和LDL氧化
Hemopexin（20 μM）显著抑制了血红素/H2O2诱导的CO产生，并显著减少了共轭二烯和TBARs形成，表明游离血红素是LDL氧化过程中CO生成所必需的。
3.8 血红素清除剂A1M存在于LDL制剂中并抑制LDL氧化
免疫印迹在三位供体的LDL制剂中均检测到A1M免疫反应性，ELISA进一步定量确认了A1M的存在。功能实验表明，A1M（20 μM）显著减弱了血红素/H2O2诱导的共轭二烯和TBARs形成。
五、讨论总结与研究结论
本研究的核心发现是天然LDL含有可检测的HO-1和A1M，同时证明血红素和H2O2在LDL氧化修饰过程中促进CO释放。HO-1作为降解促氧化血红素的细胞保护酶，其与循环LDL的关联此前未被广泛探索。研究结果提示，LDL相关的血红素调控蛋白可能在血管腔内的氧化损伤与抗氧化防御平衡中发挥作用。
研究证实血红素在H2O2存在下既作为催化剂又作为底物，促进LDL脂质过氧化的有效启动和传播，同时经历结构降解，形成自我放大的氧化过程。HO-1抑制和铁螯合的瞬时保护效应表明，HO-1相关的铁释放主要贡献于血红素介导LDL氧化的早期阶段，而脂质过氧化一旦启动即可通过自由基链式反应自主传播。BHT的持续抑制作用进一步支持脂质过氧化与血红素降解之间的密切关联，并提示Soret信号丢失不仅归因于HO-1酶促降解，氧化修饰/破坏也贡献显著。
HO-1抑制剂效果随时间减弱最合理的解释是咪唑类抑制剂与人HO-1的可逆非共价结合——当血红素铁被还原为Fe2+后，CO与铁的结合强于抑制剂的咪唑氮配位，从而置换抑制剂。Hemopexin以极高的亲和力（Kd ≈ 10?13 M）以1:1化学计量比结合血红素，通过限制游离血红素的促氧化活性来抑制LDL氧化和CO产生。
本研究首次提供了HO-1和A1M存在于LDL中的证据，扩展了对LDL颗粒蛋白质组成的新认识，提示LDL可能通过此前未被识别的机制参与血红素代谢和氧化过程。HO-1相关的血红素代谢与铁依赖性氧化还原化学共同促进了血红素/H2O2诱导的LDL氧化的早期阶段，但脂质氧化的传播不依赖于持续的HO-1活性。这些发现推进了对血红素代谢与LDL氧化相互作用的理解，可能对氧化应激相关心血管疾病的发病机制具有重要启示意义。
