《Current Biology》：An ancient polymorphism in myosin I a/b determines chiral variation in Japanese Euhadra snails
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左右（LR）不对称是动物发育的一个基本特征，然而，由于几乎所有动物通常不会在其不对称方向上发生变异，这限制了人们对其建立机制的理解。蜗牛是一个例外，因为某些野生物种表现出丰富的变异——体现在外壳卷曲方向或“手性”上，且外部可见——然而现有知识来自
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左右（LR）不对称是动物发育的一个基本特征，然而，由于几乎所有动物通常不会在其不对称方向上发生变异，这限制了人们对其建立机制的理解。蜗牛是一个例外，因为某些野生物种表现出丰富的变异——体现在外壳卷曲方向或“手性”上，且外部可见——然而现有知识来自包括池塘蜗牛Lymnaea stagnalis在内的物种，在这些物种中，左旋突变是罕见的且会导致病理。本研究表明，日本Euhadra蜗牛的手性多态性源于一种非典型肌球蛋白I a/b（myosin I a/b）的功能变异，该肌球蛋白家族成员此前未在任何动物中被牵涉到左右（LR）特化中。左旋和右旋基因变异均为古老型，在单细胞胚胎中仅产生极小的转录差异，且与病理无关。分析表明，松弛选择（relaxed selection）使得Euhadra左旋型肌球蛋白马达结构域及马达-杠杆连接区发生了显性作用的氨基酸替换，可能影响肌动球蛋白（actomyosin）相互作用。作为比较，研究人员发现，在池塘蜗牛中，由于一个formin基因的移码突变，右旋与左旋胚胎之间有数千个基因差异表达。总体而言，这些结果强化了肌球蛋白和肌动蛋白驱动过程在左右（LR）对称性破缺中的作用，拓宽了已知的分子谱系，并突出了肌球蛋白中值得进一步探索的关键突变和位置，包括在其他动物中。
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一、研究背景与科学问题
左右（LR）不对称性是动物发育中的一项基本特征，涉及内脏器官的定向排列和身体结构的镜像分化。然而，一个长期制约该领域进展的瓶颈在于：绝大多数动物物种在正常发育中并不会出现左右方向的自然变异，因此研究者很难在自然种群中直接观察左右不对称的进化改变机制。蜗牛是罕见的例外——某些野生蜗牛物种的壳卷方向（手性）存在丰富的自然变异，表现为右旋（dextral）或左旋（sinistral）。蜗牛手性由一个单孟德尔母性效应位点控制，该位点决定早期胚胎螺旋分裂的顺时针或逆时针方向，最终产生手性不对称的身体和外壳。
然而，此前对蜗牛手性遗传机制的研究主要集中于突变型蜗牛，其中最典型的案例是池塘蜗牛Lymnaea stagnalis中一个重复formin基因Lsdia2的移码突变导致极罕见的左旋表型，但这种突变具有病理效应——仅约50%的胚胎能够孵化。相比之下，野生陆生蜗牛中丰富的手性变异经过自然选择筛选，其决定基因此前完全未知。因此，研究者面临的核心问题是：自然种群中手性变异的遗传基础是什么？与病理突变相比，自然变异如何在不产生病理效应的前提下改变左右不对称？
二、研究内容与主要结论
研究人员建立了日本Euhadra蜗牛作为研究自然手性变异的模型系统。该属有超过30个物种，其中4个物种完全为左旋，而Euhadra quaesita这一物种在手性上表现出地理变异。研究人员利用新的染色体水平基因组组装，结合来自4个右旋/左旋接触区的E. quaesita样本及多种其他Euhadra物种，通过全基因组关联研究（GWAS）和多种进化基因组学方法，最终确定手性变异与一种非典型肌球蛋白I a/b（myosin I a/b）基因的功能变异相关。该肌球蛋白旁系同源物此前从未在任何动物中被牵涉到左右特化中。研究还表明，左旋和右旋基因变异均为古老型，在单细胞胚胎中仅产生极小的转录差异，且不伴随病理效应。该发现扩展了已知的能够建立生物体手性的细胞骨架机制多样性，并为理解分子尺度不对称如何传播到整体水平提供了新框架。
三、关键技术方法
研究人员使用了多项关键技术方法。样本方面，研究涉及来自日本北部4个接触区的野生E. quaesita蜗牛，以及多种其他Euhadra物种，并包括一个独立的107个个体的大型ddRAD数据集。核心技术包括：利用PacBio HiFi和Oxford Nanopore长读长及Hi-C技术进行染色体水平的de novo基因组组装；对个体蜗牛进行5–10×深度的Illumina全基因组重测序；使用Gaston线性混合模型进行全基因组关联分析；采用滑动窗口Fst/Dxy分析、TWISST拓扑加权分析、ASTRAL物种树构建等进化基因组学方法；应用单细胞RNA-seq（SMART-Seq3协议）比较左右旋胚胎的转录差异；利用SWISS-MODEL和AlphaFold2进行蛋白质结构建模，并结合肌动蛋白结合型肌球蛋白I c冷冻电镜结构（PDB: 9CFU）进行结构分析；使用RELAX和BUSTED方法检测选择压力变化。
四、研究结果
右旋与左旋蜗牛之间的基因流动。 研究人员在日本北部确定了4个右旋与左旋E. quaesita的接触区，其中新潟县#4位点为完全同域分布。实验室观察表明，来自#4位点的蜗牛母亲产生的后代手性固定，部分后代与母亲手性相反，证实手性为母性遗传。研究人员还观察到左右旋蜗牛之间可以进行单侧交配。孵化率分析显示，遗传上右旋和左旋蜗牛的孵化率无显著差异，表明两种手性版本均不具有病理效应。
Euhadra蜗牛左旋性的单一起源。 全基因组系统发育分析显示，包含4个完全左旋物种及手性可变的E. quaesita群形成一个单系群，这与左旋性从右旋祖先单次进化、随后在E. quaesita群内发生右旋回复的假说一致。同域位点#4的蜗牛形成单系群但手性混杂，支持两种手性类型之间存在当代基因流动。混合分析显示E. quaesita按地理而非手性聚类。
手性位点位于27号染色体的一个区域内。 全基因组关联分析在27号染色体（73.6–74.1 Mb）发现显著的关联峰，在4号染色体（约17.7–17.9 Mb）发现一个低于严格阈值的次峰。滑动窗口Fst分析在27号染色体同一位置检测到一致信号。基于单倍型的系统发育显示，27号染色体区域能完美分离右旋和左旋个体，而4号染色体区域有两个个体异常。全物种系统发育显示右旋和左旋谱系均为古老型，与无病理效应一致。
一种非典型肌球蛋白I决定手性变异。 候选区域内的基因注释和转录组证据表明，27号染色体上的肌球蛋白I基因外显子恰好覆盖整个候选区域（73.6–74.1 Mb）。区域内的另一个候选基因RAP1在单细胞胚胎中不表达，因此不太可能参与。单倍型比较表明左旋等位基因为显性作用。
E. quaesita胚胎转录差异极小而L. stagnalis胚胎差异巨大。 对纯合左旋（SS）和右旋（DD）E. quaesita单细胞胚胎进行RNA-seq分析，未发现肌球蛋白表达差异，仅22个基因（0.08%）存在显著差异表达。作为对比，L. stagnalis左右旋胚胎间有3,005个基因（17%）差异表达，其中差异最显著的基因是推定的肌动蛋白相关蛋白6，致病基因formin Ldia2为第35个最显著差异表达基因。
左右不对称由肌球蛋白I a/b的氨基酸变化决定。 系统发育分析表明该基因为非典型肌球蛋白I a/b。左旋型肌球蛋白有8个在所有左旋Euhadra中固定且在任何右旋Euhadra中不存在的氨基酸变化，其中3个为非保守替换（G132W、C467Y和C486Y），PROVEAN分析预测这3个变化均具有功能重要性。相比之下，右旋单系群没有任何谱系特异的氨基酸变化。
手性变化由左旋肌球蛋白I a/b等位基因的选择松弛所促成。 RELAX分析检测到焦点分支上显著的选择约束松弛（k = 0.24，LR = 11.63，p = 0.001），背景分支以强纯化选择为主（ω ≈ 0.05–0.07），而焦点分支的ω值大幅上升（ω ≈ 0.49），表明纯化选择的整体减弱而非适应性进化。BUSTED分析未发现基因全长的间歇性多样化选择的证据（p = 0.237）。
保守的整体结构但推定的功能重要氨基酸替换。 左右旋肌球蛋白模型的叠加显示相同骨架和未改变的整体结构（RMSD 0.058 ?）。3个非保守替换（G132W、C467Y和C486Y）位于马达结构域和马达-杠杆连接区附近，可能重塑局部氢键网络，改变刚度、顺应性或耦合效率。在肌动蛋白结合的肌球蛋白I结构中，486位在左旋型中距肌动蛋白Ser350约7 ?，而右旋型约10 ?；467位位于经典肌动蛋白结合表面，左旋型可能更接近肌动蛋白Leu349和Ile345；G132W在面向外的马达-杠杆连接区附近引入大量位阻。作为比较，57个可用腹足类转录组中132和467位完全不变，486位除一个物种外也不变。
软体动物左右不对称的背景。 该发现代表了理解左右不对称机制多样性的重大进展：首次在任何动物中将I类a/b肌球蛋白牵涉到左右不对称的定向中；同时表明尽管与formin作用于相同的细胞骨架通路，不同谱系的蜗牛手性变异可由不同的分子组分决定。
五、讨论与结论
讨论部分指出，在果蝇中，左右扭转方向可能取决于特定肌球蛋白I旁系同源物的生化和生物物理特性，而Euhadra肌球蛋白变异若以类似方式改变马达活性，可为反转分裂手性提供直接的机制解释。肌球蛋白I b已被证明可在体外解聚肌动蛋白的barbed端，而L. stagnalis中的致病formin Ldia2是肌动蛋白延伸因子，肌动蛋白组装和去组装动力学的微小变化可能是蜗牛手性变异的关键。下一步的重要工作是确定左旋肌球蛋白I a/b变异的功能后果，理想方案是在蜗牛中工程化单个氨基酸变化，但目前在蜗牛中尚无操纵编码变异的先例。另一个策略是在其他物种中应用基因编辑方法，鉴定负责手性转换的单个氨基酸，并确定是否存在作为该变化前提的许可性或其他背景替换。
研究结论表明，一个此前未被认识的非典型肌球蛋白I家族成员是E. quaesita左右不对称自然遗传变异的基础，扩展了能够建立生物体手性的细胞骨架机制的已知多样性。这一发现加深了对分子尺度不对称如何传播到整体水平的理解，并凸显了蜗牛作为解析左右根本起源的杰出模型的价值。
