基于理性设计的苯基与菲基咪唑杂合体用于乳腺癌治疗——一项构效关系研究

《Molecules》：Rationally Designed Phenyl- and Phenanthryl-Based Imidazole Hybrids for the Treatment of Breast Cancer—A Structure–Activity Relationship Study

　　

摘要专业翻译 合成了一系列11个苯基–咪唑–吡咯化合物和9个菲基–咪唑–吡咯化合物，并针对雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）表达不同的乳腺癌细胞系进行了活性评价，包括BT-474（ER+、PR+、HER2+）、T-47D和MCF-7（ER+、PR+、HER2?）以及MDA-MB-468和MDA-MB-231（ER?、PR?、HER2?）。结果分析表明，苯基–咪唑–吡咯系列中最具活性的化合物为5d和5k，菲基–咪唑–吡咯系列中最具活性的化合物为6b和6i（半数抑制浓度IC50 < 50 μM）。分子对接（MD）和分子动力学模拟（MDS）研究表明，活性化合物对7NH5蛋白（Akt1与其特异性抑制剂的共晶结构）表现出高结合亲和力，该蛋白在多种乳腺癌类型中过表达。活性化合物6b和6i通过诱导细胞死亡机制降低了MDA-MB-231和MCF-7细胞的活力。两种化合物均通过将细胞阻滞在细胞周期G0/G1期来抑制增殖，其结果与传统顺铂（Cisplatin）相似。腹腔注射6i可延缓艾氏腹水癌（EAC）肿瘤的发展，并与荷瘤对照组和5-氟尿嘧啶（5FU）阳性对照组小鼠相比延长了小鼠的生存期。

论文解读

一、研究背景与科学问题

乳腺癌是全球最常见的恶性肿瘤，世界卫生组织报告过去三年中已有780万女性被诊断患有乳腺癌。雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）是乳腺癌的关键分子标志物，其表达状态直接影响预后判断和治疗方案选择。三阴性乳腺癌（TNBC）缺乏上述三种受体的表达，目前主要依赖提升细胞内活性氧（ROS）水平、导致线粒体功能障碍和凋亡性细胞死亡的化合物进行治疗。

咪唑环已被确认为靶向乳腺癌PI3K/AKT/mTOR信号轴的有效药效团，三取代咪唑可通过下调Akt/PDK/mTOR磷酸化诱导乳腺癌细胞凋亡。Akt通过激活细胞周期蛋白D1并抑制p21/p27和p53的表达驱动癌细胞增殖，因此理性靶向这一生存激酶是可行的治疗策略。尽管基于咪唑骨架的化疗药物如达卡巴嗪（Dacarbazine）、唑来膦酸（Zoledronic acid）、尼洛替尼（Nilotinib）和阿西米尼（Asciminib）已应用于临床，但截至目前尚无咪唑衍生物获得FDA批准用于乳腺癌治疗。本研究旨在合成一系列三取代和四取代咪唑衍生物作为乳腺癌细胞增殖的有效抑制剂，通过系统改变取代基探索构效关系（SAR），并筛选具有开发潜力的先导化合物。

二、研究内容与主要结论

研究人员设计并合成了两个系列的咪唑–吡咯杂合化合物：苯基–咪唑–吡咯系列（5a–5k，11个化合物）和菲基–咪唑–吡咯系列（6a–6i，9个化合物）。咪唑环N1位引入不同脂肪链和芳香基团以调节亲脂性和膜通透性，2位连接N-甲基吡咯单元，4、5位分别由苯基或菲基占据以探究芳香表面积对Akt1结合的影响。体外活性评价显示，苯基系列中5d（N1-辛基）和5k（N1-庚基）对BT-474细胞系表现出最优细胞毒性（IC₅₀分别为32.08 μM和25.69 μM），且随N1位烷基链增长IC₅₀值呈下降趋势。菲基系列中6b（N1-乙基）和6i（N1-间酚基）对MDA-MB-231和MCF-7细胞系表现出最佳抑制活性，IC₅₀值分别为41.19 μM和40.37 μM。化合物6i对正常角质形成细胞系HaCaT的毒性最低，表现出良好的肿瘤细胞选择性。体内研究采用艾氏腹水癌（EAC）实体瘤模型，腹腔注射10 mg/kg和30 mg/kg的6i均可有效延缓肿瘤生长，Kaplan–Meier生存分析显示6i治疗组小鼠生存期显著优于对照组和5-氟尿嘧啶（5FU）阳性对照组。组织病理学检查证实6i低剂量组肿瘤组织出现治疗反应性坏死，肝组织炎症浸润减少。分子对接研究表明6h和6i对Akt1（PDB ID：7NH5）具有最优 docking 评分（?13.8和?13.7 kcal/mol），主要通过π–π堆积、疏水相互作用和极性相互作用稳定结合于PH–激酶结构域间变构口袋。200 ns分子动力学模拟证实6i与7NH5复合物整体稳定，配体RMSD稳定在0.4–0.6 nm，蛋白骨架RMSD围绕0.35 nm窄幅波动，His207与配体N1原子间氢键在55.39%的模拟时间内持续存在。密度泛函理论（DFT）计算显示活性化合物6i的HOMO–LUMO能隙为0.1443 Ha，表明其具有良好的电子稳定性。

三、关键技术方法

本研究采用一锅多组分反应（Radziszewski合成）制备三取代咪唑骨架，以碘为催化剂，苯偶酰（benzil）或9,10-菲醌（9,10-phenanthraquinone）分别与N-甲基吡咯-2-甲醛和乙酸铵反应；四取代咪唑通过引入伯胺或采用N-烷基化反应（碳酸钾为碱、乙腈为溶剂）制备。化合物经硅胶柱色谱纯化，通过¹H-NMR、¹³C-NMR、红外光谱（FT-IR）和质谱进行结构表征。体外细胞毒性采用磺酰罗丹明B（SRB）法检测，细胞系包括BT-474、T-47D、MCF-7、MDA-MB-468、MDA-MB-231（乳腺癌）以及HaCaT（人角质形成细胞）和L929（小鼠成纤维细胞）正常细胞系。细胞周期分析采用NucleoCounter NC-3000系统DAPI染色法，细胞死亡检测采用吖啶橙/溴化乙锭（AO/EtBr）双荧光染色，ROS水平采用H2DCFDA荧光探针法测定。体内实验使用BALB/c小鼠（8–9周龄，25 ± 2 g），EAC细胞（1 × 10⁶细胞/鼠）皮下接种于后肢建立实体瘤模型，腹腔注射给药，每两天一次共6次。分子对接采用Autodock Vina 1.2.5，DFT计算采用ORCA 5.0.4（B3LYP泛函，def2-TZVP基组），分子动力学模拟采用GROMACS（CHARMM36全原子力场，200 ns生产运行）。

四、研究结果

合成与结构表征：通过一锅多组分反应和N-烷基化反应成功合成了14个新型咪唑–吡咯化合物。催化剂比较实验表明，碘催化产率最高。所有化合物经色谱纯化后通过多种波谱技术确认结构，LC纯度达98%。

苯基–咪唑–吡咯系列（5a–5k）的体外抗增殖活性：化合物5d和5k对BT-474细胞系表现出最佳细胞毒性（IC₅₀分别为32.08 μM和25.69 μM）。N1位烷基链延长可降低IC₅₀值，但5a和5b对正常L929细胞毒性较高，治疗指数低，不适合作为先导化合物。

菲基–咪唑–吡咯系列（6a–6i）的体外抗增殖活性：6b对MDA-MB-231细胞在50 μM浓度下抑制率达65.64%，6i对MCF-7细胞抑制率为54.17%。6b和6i对HaCaT正常细胞毒性较低，其中6i毒性最低，表现出良好的选择性。

细胞周期阻滞与细胞死亡机制：AO/EtBr染色显示6b和6i呈剂量依赖性诱导细胞死亡，MDA-MB-231细胞较MCF-7更敏感。DAPI染色细胞周期分析表明两种化合物均引起G0/G1期阻滞和sub-G0/G1亚群增加，证实通过诱导凋亡和阻滞细胞周期进展抑制癌细胞增殖。

ROS诱导：6b在MDA-MB-231细胞系中ROS诱导效果优于6i，而6i在MCF-7细胞系中ROS诱导更佳，呈现细胞系依赖性差异。

体内抗肿瘤活性：6i（10 mg/kg和30 mg/kg）腹腔注射可显著延缓EAC实体瘤生长（p < 0.005），Kaplan–Meier生存分析显示6i治疗组生存获益优于对照组和5FU组。组织病理学检查证实6i低剂量组肿瘤组织出现治疗反应性坏死，肝组织炎症浸润减少，未见明显毒性。

分子对接与分子动力学模拟：6h和6i对Akt1（7NH5）的docking评分最优（?13.8和?13.7 kcal/mol），通过π–π堆积（Trp80）、疏水接触（Val270、Leu264）和极性相互作用（Asp292）稳定结合于PH–激酶间变构口袋。200 ns MDS证实6i–7NH5复合物整体稳定，His207与配体N1原子间氢键在55.39%的模拟时间内持续存在。

五、讨论与结论

讨论部分指出，将苯基替换为菲基可增强咪唑–吡咯化合物的生物活性，菲基系列表现出更好的安全性。苯基系列中N1位最长脂肪链（庚基、辛基）取代的化合物活性最优，菲基系列中N1位乙基和间酚基取代的化合物活性最佳。与既往报道的三唑类咪唑盐（IC₅₀为170.58和200.84 μg/mL）相比，本研究的四取代咪唑衍生物对乳腺癌细胞表现出更优的效价。分子对接和动力学模拟结果与体外活性一致，支持Akt1抑制作为抗增殖活性的分子机制。化合物6i因兼具良好抗癌活性和低正常细胞毒性，被选为体内研究的候选化合物。

结论部分总结：咪唑–吡咯杂合体的合成方法成功且结果令人鼓舞。苯基–咪唑–吡咯系列中具最长脂肪链的5d和5k表现出良好抗肿瘤活性；菲基–咪唑–吡咯系列中6b和6i活性良好且对正常细胞（HaCaT）毒性最低。6b和6i通过G0/G1期阻滞抑制细胞增殖并诱导凋亡，在较高浓度下6i在MDA-MB-231和MCF-7细胞中均产生更多死亡细胞。体内研究表明6i可减少EAC实体瘤小鼠模型中的肿瘤生长并延长荷瘤小鼠生存期。这些发现支持6i作为候选化合物值得进一步研究和结构优化。