白术（Atractylodes macrocephala Koidz）提取物作为多靶点天然功能成分修复皮肤屏障的机制与功效评价

《Molecules》：Evaluation of Atractylodes macrocephala Koidz Extract as a Multi-Functional Natural Ingredient for Skin Barrier Repair

　　

摘要：表皮屏障损伤可触发敏感性皮肤疾病。合成皮肤修复剂常引起刺激，而药食同源草药成分提供更温和的替代方案。作为一种传统中草药，白术（Atractylodes macrocephala Koidz）在表皮屏障修复功效方面仍表征不足。该研究通过角质形成细胞损伤模型、生化测定、光谱相互作用分析、分子对接及胶带剥离诱导的小鼠皮肤屏障损伤模型，系统表征了白术提取物（AKE，Atractylodes macrocephala Koidz extract）的屏障修复能力。AKE促进角质形成细胞迁移，减轻十二烷基硫酸钠（SLS，sodium lauryl sulfate）触发的氧化损伤，并增强神经酰胺合成。此外，AKE抑制透明质酸酶（HAase，hyaluronidase）、胶原酶和弹性蛋白酶活性。荧光猝灭光谱和热力学分析证明AKE成分与这些皮肤降解酶之间发生自发结合。在50 μg/mL时，AKE通过抑制NF-κB（nuclear factor kappa-B）炎症级联反应下调促炎细胞因子白介素（IL）-6和IL-8的表达，并恢复闭合蛋白（occludin）和角蛋白（keratin）水平（p < 0.01 vs. 模型组）。AKE还对石膏样小孢子菌（Microsporum gypseum）发挥抗真菌活性，最低抑菌浓度（MIC，minimum inhibitory concentration）为92.36 ± 1.03 μg/mL，从而减轻与皮肤癣菌病相关的炎症和瘙痒。在屏障损伤小鼠中，局部应用AKE恢复81.2%表皮完整性（p < 0.001 vs. 模型组）并使皮肤生物标志物正常化。UHPLC-ESI-HRMS/MS（ultra-high performance liquid chromatography-electrospray ionization-high resolution mass spectrometry）结合分子对接鉴定白术内酯I-II（atractylenolide I-II）为潜在生物活性化合物。总之，AKE通过多靶点调节修复受损表皮，表明其作为皮肤屏障修复的天然功能候选物具有前景。

研究背景与问题：皮肤是机体与外界环境之间的首要防御屏障，表皮屏障由基底层、棘层、颗粒层和角质层等构成。屏障受损可导致经表皮水分丢失（TEWL，transepidermal water loss）升高，引发干燥、皱纹、红斑、灼热和肿胀等敏感皮肤症状。文献报道全球71%成人报告任何程度敏感皮肤，40%有中重度症状。自1949年以来，氢化可的松和维A酸等合成药物用于炎症性皮肤病，但可能引起灼热、红斑、肿胀和瘙痒，限制敏感皮肤使用。药食同源草药活性成分因安全、温和、低刺激受到关注。传统中医学记载多种皮肤保护潜力草药，但系统药理验证有限，尤其多靶点分子机制不足。研究选取四种药食同源草药：白术（Atractylodes macrocephala Koidz，A. macrocephala）、芍药（Paeonia lactiflora Pall.，P. lactiflora）、铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo，D. officinale）和玉竹（Polygonatum odoratum (Mill.) Druce，P. odoratum）。初步一氧化氮（NO，nitric oxide）抑制实验显示A. macrocephala提取物（AKE，Atractylodes macrocephala Koidz extract）和P. lactiflora提取物（PPE，Paeonia lactiflora Pall. extract）抗炎较强。A. macrocephala研究多聚焦胃肠调节和免疫调节，表皮屏障修复机制研究不足，因此开展本研究。

研究开展、结论和意义：研究人员系统评价AKE修复皮肤屏障能力，PPE作为对照。采用角质形成细胞损伤模型、生化酶抑制、荧光猝灭、分子对接、UHPLC-ESI-HRMS/MS和胶带剥离小鼠模型。结论：AKE通过促进角质形成细胞迁移、减轻SLS诱导氧化损伤、增强神经酰胺合成、抑制HAase、胶原酶和弹性蛋白酶、稳定紧密连接蛋白、抑制NF-κB介导炎症、抗皮肤癣菌等多靶点修复受损表皮；小鼠局部应用恢复81.2%表皮完整性，优于PPE和青刺果油（Prinsepia utilis Royle oil，PURO）。鉴定atractylenolide I-II为潜在活性成分。意义：为AKE作为天然多功能皮肤屏障修复成分提供理论依据。

关键技术方法（≤250字）：包括NO抑制筛选、SLS诱导HaCaT损伤模型、划痕愈合、DCFH-DA检测活性氧（ROS，reactive oxygen species）、酶联免疫吸附测定（ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay）、生化酶抑制、荧光猝灭、蛋白质印迹（Western blot）、UHPLC-ESI-HRMS/MS、分子对接和胶带剥离小鼠模型。样本来源：植物购自昆明螺蛳湾国际商贸城草药市场（2023年4月），原植物2022年9月采自云南玉龙、马关、腾冲，由云南大学Dr. Ying Zhou鉴定；HaCaT与RAW264.7细胞；M. gypseum CBS118893来自中国医学科学院医学真菌保藏中心；6周龄雄性CD-1/ICR小鼠18只（湖南SJA Laboratory Animal Co., Ltd.），随机6组每组3只。

研究结果：
2.1 药用植物筛选与提取：通过LPS刺激RAW264.7巨噬细胞NO抑制实验，A. macrocephala和P. lactiflora抑制率分别为97.39%和77.06%，选择AKE为主要研究对象，PPE为对照。
2.2 细胞活力测定：AKE和PPE在0.5–62.5 μg/mL对HaCaT无显著不良影响，不超过12.5 μg/mL促进增殖（p < 0.05），生物相容性良好。
2.3 伤口愈合活性：划痕实验显示50 μg/mL AKE和PPE处理24 h促进HaCaT迁移，迁移率较未处理对照增加超过10%（p < 0.01）。
2.4 提取物对SLS诱导HaCaT细胞ROS分泌的影响：20 μg/mL SLS建立损伤模型，细胞活力降至76.24%；DCFH-DA（2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯，2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate）染色显示AKE有效抑制细胞内ROS爆发，抗氧化能力强。
2.5 对神经酰胺合成促进作用的评价：ELISA显示AKE在6.25–40 μg/mL持续增加神经酰胺，12.5 μg/mL时较基线增加1.61倍，优于PURO；SLS损伤后24 h恢复神经酰胺，并持续至72 h。
2.6 体外酶活性抑制：生化抑制实验显示AKE剂量依赖性抑制皮肤降解酶。
2.6.1 透明质酸酶抑制活性：AKE对HAase的IC₅₀为0.5544 mg/mL，优于熊果酸（0.6975 mg/mL）和PPE（1.293 mg/mL）。
2.6.2 胶原酶抑制活性：AKE对胶原酶IC₅₀为1.220 mg/mL，优于熊果酸（1.228 mg/mL），在2–5 mg/mL保持良好抑制。
2.6.3 弹性蛋白酶抑制活性：AKE对弹性蛋白酶IC₅₀为0.4304 mg/mL，显著优于熊果酸（1.434 mg/mL）和PPE（2.839 mg/mL）。
2.7 抗炎活性：ELISA显示SLS损伤模型IL-6和IL-8升高；AKE在6.25–50 μg/mL浓度依赖性抑制，50 μg/mL最大抑制（p < 0.001），PPE需更高浓度。
2.8 对紧密连接蛋白水平的调控作用：ELISA显示SLS降低occludin并诱导keratin过度合成；AKE在6.25–50 μg/mL升高occludin（50 μg/mL增至2.24倍）并抑制异常keratin，72 h强于PURO（p < 0.05）。
2.9 提取物对表皮屏障生物标志物和NF-κB炎症通路的影响：Western blot显示SLS下调丝氨酸棕榈酰转移酶长链1（SPTLC1，serine palmitoyltransferase long chain-1）、兜甲蛋白（loricrin）、occludin，上调p-IκBα/IκBα和p-p65/p65；AKE逆转这些变化（p < 0.001），恢复屏障蛋白并抑制NF-κB活化。
2.10 荧光猝灭测量：荧光猝灭光谱显示AKE与HAase、弹性蛋白酶、胶原酶结合，发射峰红移；Stern–Volmer分析显示K_SV线性良好（R² > 0.98），部分复合物为动态猝灭，其余为静态猝灭。
2.10.1 结合参数定量与结合位点表征：双对数方程得结合常数K_a和结合位点数n，n在300–320 K接近1，表明每种酶存在单一抑制口袋。
2.10.2 热力学参数与结合力分析：吉布斯自由能变化（ΔG）均为负，结合自发；AKE–胶原酶和PPE–HAase以疏水作用为主（ΔH、ΔS正），其余复合物以范德华力和氢键为主（ΔH、ΔS负）。
2.11 抗皮肤癣菌活性评估：抗M. gypseum实验显示AKE抑制率65.653 ± 1.735%，MIC为92.357 ± 1.032 μg/mL，优于PPE（33.032 ± 0.21%），具剂量依赖性。
2.12 提取物修复皮肤屏障的初步研究：胶带剥离小鼠局部用10%提取物霜8天，AKE使TEWL恢复81.2%，优于PPE 79.3%和PURO 56.4%；表皮厚度从71.91 μm降至26.01 μm，PURO为48.45 μm；ceramide和occludin升至接近健康水平，keratin异常表达受抑（p < 0.001），部分优于PURO（p < 0.001）。
2.13 提取物成分的LC-MS/MS分析：UHPLC-ESI-HRMS/MS正离子模式鉴定AKE中atractylenolide I（m/z 231.1384 [M+H]⁺、253.1203 [M+Na]⁺）和atractylenolide II（m/z 233.1537 [M+H]⁺、255.1354 [M+Na]⁺），质量偏差≤5 ppm；PPE中主要成分为paeoniflorin和albiflorin。
2.14 分子对接：对接显示atractylenolide I和II与HAase、胶原酶、弹性蛋白酶形成稳定复合物；对HAase结合能分别为?7.76和?8.00 kcal/mol，优于paeoniflorin（?5.81）和albiflorin（?5.40），与酶抑制实验结果一致。

讨论部分总结：讨论认为AKE相较已报道植物提取物具有多靶点优势：神经酰胺快速持续恢复、同时抑制IL-6/IL-8、兼具酶抑制和抗真菌。研究局限包括动物样本量有限，可能影响统计；仅评价局部皮肤修复，未检测血浆和主要器官，系统生物分布和安全性不明；未评估皮肤微生物组成和多样性。未来需扩大动物样本或人体试验，开展系统体内安全性，并加入皮肤微生物组分析。

研究结论（翻译）：天然草本提取物是开发温和屏障修复成分的理想来源之一。既往对A. macrocephala的研究主要集中于胃肠道和免疫调节，其皮肤修复应用仍未被充分考察。在本研究中，研究人员比较评估了AKE和PPE的皮肤屏障保护性能，并通过一系列实验证明AKE具有更优的多通路功效，可修复受损表皮稳态，弥补了该领域现有研究空白。在细胞水平，AKE促进HaCaT角质形成细胞迁移，减轻SLS诱导的氧化损伤，并显著上调细胞内神经酰胺生物合成，这对重建角质层细胞间基质不可或缺。生化酶实验证实AKE抑制HAase、胶原酶和弹性蛋白酶催化活性，这三种重要水解酶负责细胞外基质降解、皮肤干燥和皮肤老化。荧光猝灭光谱结合热力学计算证明AKE成分与这些皮肤降解酶之间发生自发非共价结合，为其酶抑制效应提供分子解释。在炎症调节方面，AKE显著降低促炎细胞因子IL-6和IL-8产生，恢复紧密连接蛋白occludin水平，使失调的keratin水平正常化，并抑制受损角质形成细胞中NF-κB信号通路活化。此外，AKE对病原性皮肤癣菌M. gypseum显示抑制活性，MIC为92.357 ± 1.032 μg/mL，提示其缓解皮肤癣菌病相关瘙痒和炎症的潜力。与体外观察一致，局部应用AKE在胶带剥离小鼠中实现81.2%表皮完整性恢复率，优于PPE和商业化成分PURO。AKE干预有效逆转关键皮肤生物物理指标异常，包括TEWL、表面pH、弹性和角质层水合。组织病理学分析证实该处理有效减少表皮增生，同时使组织ceramide和occludin浓度正常化。随后UHPLC-ESI-HRMS/MS分析和分子对接模拟鉴定atractylenolide I和atractylenolide II的潜在贡献。总之，研究结果表明AKE通过多靶点调控脂质合成、ROS清除、抑制皮肤降解酶、稳定紧密连接蛋白、抑制NF-κB介导炎症和抗皮肤癣菌活性修复受损皮肤屏障。这种多靶点调控突出AKE是一种具有维持表皮屏障完整性和缓解敏感皮肤症状潜力的功能成分。未来需要从该提取物中分离单一纯化合物并阐明其潜在分子机制，以促进实际转化和应用。