二苯吡拉林衍生物作为CB1大麻素受体的别构激动剂：基于孕烯醇酮与胆固醇结合位点的信号调控机制研究

《Molecules》：Diphenylpyraline Derivatives Are Allosteric Agonists of the CB1 Cannabinoid Receptor

　　

二苯吡拉林（Diphenylpyraline）类似物JKH1和JKH10是单胺转运体抑制剂，可促进小鼠肠系膜动脉的舒张。本研究评估了JKH1和JKH10与CB1大麻素受体信号传导的相互作用。在内源性表达CB1受体的N18TG2小鼠神经母细胞瘤细胞中，JKH1和JKH10以浓度依赖方式刺激[35S]GTPγS结合；这种刺激被CB1拮抗剂-反向激动剂SR141716（1 μM）非竞争性拮抗。JKH10（而非JKH1）抑制毛喉素（forskolin）刺激的cAMP积累，其效力与完全正构激动剂WIN55212-2相当，且这种Gi介导的抑制完全被百日咳毒素（pertussis toxin）处理所阻断。然而，JKH1是较差的抑制剂。SR141716未能完全阻断JKH10的抑制作用。两种JKH类似物均刺激ERK磷酸化，但SR141716（1 μM）的抑制作用似乎不能通过增加JKH1或JKH10的浓度来克服。在小鼠离体肠系膜动脉中，两种类似物（1 μM）均减弱收缩反应，但仅JKH10的反应被CB1拮抗剂-反向激动剂O-2050（1 μM）所阻断。针对蛋白质数据库（protein data bank）中CB1结构7FEE和6KQI的对接研究表明，JKH1主要被预测对接在孕烯醇酮（pregnenolone）结合位点，而JKH10被预测同时对接在孕烯醇酮结合位点和螺旋2–3–4内叶膜侧的胆固醇共有基序（cholesterol consensus motif）。因此，一系列二苯吡拉林衍生物可作为CB1受体刺激剂，计算机模拟证据支持这一作用可能源于与胆固醇和/或孕烯醇酮蛋白表面结合位点的相互作用，而非正构结合位点。

论文解读

一、研究背景与意义

CB₁大麻素受体（CB₁ cannabinoid receptor）是脑内含量最丰富的G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor, GPCR），参与神经发育和突触神经传递的调控。尽管大麻素激动剂在疼痛缓解方面具有治疗价值，但其应用受到镇静、思维混乱、记忆破坏以及可能加重精神疾病等不良反应的限制。因此，寻找能够选择性调控CB₁受体信号、减少副作用的新型药物分子具有重要意义。

二苯吡拉林（diphenylpyraline, DPP）是一种单胺转运体抑制剂，具有精神运动兴奋作用。研究人员前期基于可卡因的托烷结构进行合理药物设计，合成了一系列DPP类似物，其中JKH1（4-[(4-氯苯基，苯基)甲氧基]-1-甲基哌啶）和JKH10（4-[双(4-氯苯基)甲氧基]-1-丁基哌啶）表现出最强的血管舒张活性。由于CB₁激动剂也能在肠系膜动脉中引起类似的血管舒张效应，研究人员推测CB₁受体信号可能在DPP类似物的分子水平反应中发挥作用。然而，这些单胺转运体抑制剂如何通过CB₁受体信号发挥作用尚不清楚，这构成了本研究的核心问题。

二、研究内容与主要结论

本研究系统评估了JKH1和JKH10与CB₁受体信号传导的相互作用，主要发现如下：JKH10以EC₅₀ = 33 nM的效力浓度依赖性刺激[³⁵S]GTPγS结合，而JKH1效力或效能较差（EC₅₀ > 1 μM）；JKH10有效抑制毛喉素刺激的cAMP积累（EC₅₀ = 13 nM），效力与完全正构激动剂WIN55212-2相当，且该抑制作用被百日咳毒素完全阻断，证实其通过Gi偶联受体发挥作用；两种类似物均刺激ERK1/2磷酸化，但SR141716的抑制作用不能通过增加配体浓度来克服，呈现非竞争性特征；在离体血管实验中，JKH10的血管舒张效应可被CB₁拮抗剂O-2050逆转，而JKH1则不受影响。分子对接研究表明，JKH1主要对接于孕烯醇酮结合位点，JKH10同时对接于孕烯醇酮和胆固醇结合位点，两者均不结合正构位点。这些发现首次鉴定了一类新型CB₁受体别构激动剂，为理解GPCR的脂质界面调控机制提供了新的工具分子。

三、关键技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术方法：使用N18TG2小鼠神经母细胞瘤细胞系（内源性表达CB₁受体）进行[³⁵S]GTPγS结合实验测定G蛋白总活性；通过cAMP积累实验评估Gi介导的腺苷酸环化酶抑制；采用96孔板“细胞内Western”免疫细胞化学技术定量ERK1/2磷酸化水平；使用离体小鼠肠系膜动脉（取自3月龄雄性C57BL/6小鼠，n = 9）进行血管反应性测定；利用AutoDock Vina对蛋白质数据库（PDB）中CB₁结构7FEE（与CP55940和正性别构调节剂ZCZ011共结晶）和6KQI（与CP55940和负性别构调节剂ORG27569共结晶）进行刚性分子对接。

四、研究结果

对总G蛋白活性的影响： 通过[³⁵S]GTPγS结合实验发现，JKH10以浓度依赖方式刺激G蛋白激活（EC₅₀ = 33 nM），而JKH1效能较差。SR141716（1 μM）非竞争性降低JKH10的刺激作用，剂量-反应曲线无平行右移，表明JKH10不结合正构位点。

对毛喉素刺激的cAMP积累的影响： JKH10（100 nM）显著抑制cAMP积累至27 ± 11%，EC₅₀ = 13 nM，与WIN55212-2效力相当；JKH1和DPP无显著抑制作用。百日咳毒素预处理完全阻断JKH10的抑制作用，证实其通过Gi蛋白偶联受体介导。SR141716不能完全阻断JKH10的cAMP抑制反应，进一步支持非正构位点作用机制。

对ERK1/2磷酸化的影响： 两种类似物在1–100 nM范围内浓度依赖性刺激ERK1/2磷酸化，但在1 μM时刺激减弱，形成U型剂量-反应曲线。SR141716非竞争性抑制两种类似物诱导的ERK磷酸化。

对小鼠肠系膜动脉血管反应的影响： JKH1减弱去甲肾上腺素最大收缩反应和敏感性，JKH10显著降低敏感性。O-2050完全逆转JKH10对去甲肾上腺素敏感性的影响，但不影响JKH1的作用，表明JKH10的血管效应由CB₁受体介导。

分子对接分析： JKH1主要对接于孕烯醇酮结合位点（由Val140、Leu136、Glu133、Ile395、Ala398、Leu404、Arg405和Phe408界定），JKH10同时对接于孕烯醇酮位点和胆固醇共有基序（由Leu138、Leu143、Arg148、Trp241、His154、Ser158、Val161和Leu165界定）。两种化合物均不以显著概率对接于正构位点。JKH10的苯环与Phe408形成芳香堆积相互作用，氯原子与Arg148和His154等距，另一苯环与Trp241堆叠。

五、讨论与结论

研究人员指出，JKH10表现出类似正构激动剂WIN55212-2的信号刺激特征，但其与SR141716的拮抗关系为非竞争性而非竞争性，结合对接结果，支持JKH10通过孕烯醇酮和/或胆固醇结合位点发挥别构激动作用。JKH1则表现出信号偏倚——能刺激ERK磷酸化但对Gi介导的cAMP抑制效能较差，可能通过促进Gβγ支架或β-arrestin介导的信号通路实现。孕烯醇酮被报道为CB₁负性别构调节剂，胆固醇为正性别构调节剂，而JKH10与这些位点的相互作用可促进受体活性构象的稳定。此外，多巴胺转运体也含有功能性胆固醇共有基序，提示DPP类似物可能通过类似的脂质界面位点调控多种跨膜蛋白。

研究结论：本研究表明JKH1和JKH10能够刺激细胞信号反应，且这些反应可被CB₁选择性反向激动剂SR141716和O-2050非竞争性抑制。计算机模拟分析表明两者均不对接于正构激动剂结合位点，而是预测对接于孕烯醇酮或胆固醇基序结合位点。这些结构不同的化合物在质膜内蛋白表面位点的独特对接及其功能活性，鉴定了一类新型CB₁受体别构刺激剂或偏倚别构刺激剂，可能通过类似的脂质缝隙或胆固醇结合位点调控其他整合膜蛋白。CB₁受体与其他GPCR及单胺转运体之间的共同点在于胆固醇共有基序和/或孕烯醇酮结合位点，这一发现为研究胆固醇在脂筏中的调控作用及环状脂质在膜蛋白功能调节中的作用提供了重要工具。