转移体递送系统解锁咪喹莫特治疗实验性皮肤利什曼病的治疗潜力

《Microorganisms》：Transferosome Delivery Unlocks the Therapeutic Potential of Imiquimod for Experimental Cutaneous Leishmaniasis

　　

药物再利用为被忽视的传染病提供了有吸引力的策略，但治疗效果可能受到药物递送至感染部位不足的限制。咪喹莫特（IQ）是一种局部免疫调节剂，已显示出对抗皮肤利什曼病（CL）的潜力；然而，增强其局部治疗效果同时最大限度减少药物暴露的策略仍然有限。在此，研究人员开发了负载咪喹莫特的转移体（IQ-TFs）作为纳米增强型局部递送系统，并评估了其药学性能、皮肤递送特性以及对由亚马逊利什曼原虫（L.（L.）amazonensis）引起的实验性CL的抗利什曼疗效。通过薄膜水化法制备的IQ-TFs粒径为596 ± 73 nm，多分散性低（0.20 ± 0.02），Zeta电位为（?15.2 ± 1.8 mV），包封率高（71.2 ± 18.7%）。将IQ包封于转移体中促进了其持续渗透并延长了皮肤滞留时间，这与局部药物递送特性相一致。IQ-TFs显著增强了对前鞭毛体和细胞内无鞭毛体的抗利什曼活性。在体内实验中，局部应用IQ-TF显著降低了寄生虫载量并改善了感染相关的组织病理学改变。值得注意的是，IQ-TFs在使用的IQ剂量比市售5%乳膏低约30倍的情况下实现了这些效果，其寄生虫控制效果与全身给药的脱氧胆酸盐两性霉素B相当。这些发现表明，IQ转移体作为一种有前景的纳米技术平台，可将咪喹莫特转化为更高效、低剂量的皮肤利什曼病局部治疗方案。

研究背景与意义

皮肤利什曼病（CL）是由利什曼原虫属（Leishmania）原生动物寄生虫引起的全球性寄生虫病，通过感染雌性白蛉叮咬传播。该病是利什曼病中最常见的临床形式，其中亚马逊利什曼原虫（L.（L.）amazonensis）在美洲地区尤为重要，可引起从局限性皮肤溃疡到无反应性弥漫性皮肤利什曼病的广泛临床表现。目前可用的治疗选择有限，五价锑类药物虽为一线用药数十年，但存在显著毒性，包括恶心、呕吐、肝毒性和心脏毒性等不良反应。此外，耐药性寄生虫的出现进一步限制了现有疗法的有效性。二线药物如喷他脒、米替福新、巴龙霉素和两性霉素B（AmB）虽可用于治疗失败病例，但同样面临毒性、高成本和需要胃肠外给药等限制。两性霉素B作为参考药物，其抗利什曼活性源于对寄生虫膜中麦角甾醇的高亲和力，但临床使用受严重肾毒性限制。鉴于现有治疗的局限性，迫切需要更安全有效的局部治疗方案。纳米递送系统，特别是转移体——兼具脂质体和弹性囊泡特性的超变形脂质囊泡，因其能够穿过角质层到达深层皮肤、实现局部靶向递送并降低全身毒性的能力而受到关注。咪喹莫特（IQ）作为一种经批准的局部免疫调节剂，通过激活Toll样受体7（TLR7）诱导促炎细胞因子产生，从而消除细胞内病原体。临床前和临床研究已证明咪喹莫特可减少寄生虫载量并加速皮肤利什曼病病变愈合。然而，利什曼原虫无鞭毛体在巨噬细胞吞噬溶酶体中的细胞内定位限制了药物到达靶位点。因此，本研究旨在评估将咪喹莫特装载于转移体中对抗亚马逊利什曼原虫引起的实验性皮肤利什曼病的疗效，并与参考药物两性霉素B进行比较。

研究内容与结论

研究人员开发了负载咪喹莫特的转移体（IQ-TFs），采用薄膜水化法制备，并系统评估了其理化性质、形态特征、流变学特性、黏附性能、皮肤渗透能力以及体内外抗利什曼活性。结果表明，IQ-TFs粒径为596 ± 73 nm，多分散指数低（0.20 ± 0.02），Zeta电位为?15.2 ± 1.8 mV，包封效率高达71.2 ± 18.7%。透射电子显微镜（TEM）证实了球形囊泡形态。流变学分析显示两种转移体凝胶均呈现剪切变稀的假塑性行为，黏附力相当。体外皮肤渗透实验表明IQ-TF能够持续渗透猪耳皮肤，稳态通量（J_ss）为0.858 ± 0.132 μg/cm²/h，滞后时间为0.894 ± 0.005 h。胶带剥离实验显示咪喹莫特在角质层中累积滞留量达16.21 ± 1.24 μg。体外抗利什曼实验显示，IQ-TF对前鞭毛体的半数有效浓度（EC₅₀）在24 h和72 h分别为50 ± 2 ng/mL和4.55 ± 0.01 ng/mL，对细胞内无鞭毛体的EC₅₀分别为4 ± 2 ng/mL和1.2 ± 0.7 ng/mL，显著优于游离咪喹莫特。体内实验中，BALB/c小鼠经尾部皮下感染亚马逊利什曼原虫后，IQ-TF凝胶局部治疗显著降低了寄生虫载量（减少83.1%），效果与全身给药的脱氧胆酸盐两性霉素B（减少89.3%）相当，且使用的咪喹莫特剂量比市售5%乳膏低约30倍。组织病理学检查显示IQ-TF治疗组巨噬细胞寄生程度由重度降至中度，炎症浸润细胞组成发生改变，淋巴细胞和中性粒细胞比例增加。

关键技术方法

研究人员采用薄膜水化法制备IQ负载转移体，使用大豆磷脂酰胆碱（Lipoid S100）和脱氧胆酸钠（NaDC）作为边缘活化剂。通过动态光散射（DLS）和电泳光散射（ELS）表征粒径、多分散指数和Zeta电位。采用高效液相色谱（HPLC）定量咪喹莫特含量。体外皮肤渗透实验使用Franz扩散池，以猪耳皮肤为模型。体内实验使用BALB/c小鼠，经尾部皮下注射亚马逊利什曼原虫前鞭毛体（10⁶寄生虫/只）建立感染模型，感染30天后分组治疗10天。寄生虫载量通过有限稀释法测定，组织病理学评估采用半定量评分系统。

研究结果

3.1 理化表征：IQ-TF粒径595.7 ± 73.1 nm，Zeta电位?15.2 ± 1.8 mV，PDI为0.2 ± 0.02，包封效率71.2 ± 18.7%，药物载量为0.164%（w/w），即1.64 mg IQ/g凝胶。

3.2 形态学分析：TEM显示IQ-TF为球形囊泡结构，形态均匀，脂质膜具有柔韧性。

3.3 流变学表征：两种转移体凝胶均呈剪切变稀的非牛顿假塑性行为，在剪切速率100 s^?1时黏度分别为5.05 ± 3.57 Pa·s（IQ-TF）和5.06 ± 3.58 Pa·s（Blank-TF）。

3.4 黏附性分析：IQ-TF和Blank-TF最大黏附力分别为216 ± 3.5 mN和175 ± 3.9 mN，表明咪喹莫特装载未显著改变凝胶力学性能。

3.5 体外皮肤渗透：IQ-TF在6 h内累积渗透量为11.52 ± 9.05 μg，稳态通量0.858 ± 0.132 μg/cm²/h，渗透系数5 × 10^?4 cm²/h，滞后时间0.894 ± 0.005 h。

3.6 皮肤定位：胶带剥离实验显示咪喹莫特在角质层中累积滞留量达16.21 ± 1.24 μg，表明药物主要定位于皮肤表层。

3.7 抗利什曼和细胞毒性活性：IQ-TF对前鞭毛体EC₅₀在24 h和72 h分别为50 ± 2 ng/mL和4.55 ± 0.01 ng/mL，对无鞭毛体分别为4 ± 2 ng/mL和1.2 ± 0.7 ng/mL。Blank-TF对前鞭毛体也表现出固有活性（EC₅₀：100 ± 3 ng/mL，24 h）。IQ-TF的CC₅₀为150 ± 1 ng/mL（24 h）和270 ± 110 ng/mL（72 h）。

3.8 临床前研究：IQ-TF治疗组寄生虫载量为1.4 × 10⁶ ± 3.0 × 10⁵寄生虫/mg组织，较未治疗感染对照组（8.1 × 10⁶ ± 1.3 × 10⁶）减少83.1%，与AmB组（8.6 × 10⁵ ± 4.1 × 10⁵，减少89.3%）无统计学差异。所有治疗组病变大小随时间进展，各组间无显著差异。

3.9 组织病理学研究：IQ-TF和市售IQ乳膏治疗组巨噬细胞寄生程度由重度降至中度，炎症浸润以淋巴细胞为主，中性粒细胞比例增加。AmB治疗组坏死区域较大。未治疗和Blank-TF组表现为重度弥漫性炎症浸润，以重度寄生巨噬细胞为主。

讨论与结论

研究表明，将咪喹莫特装载于转移体可显著提高其抗利什曼活性。IQ-TF对前鞭毛体和细胞内无鞭毛体的EC₅₀值较游离咪喹莫特降低数百至数千倍，这归因于转移体增强的细胞相互作用和药物递送效率。虽然IQ-TF的体外细胞毒性增加（CC₅₀降低），但体内实验未观察到局部不耐受或体重下降，提示局部给药的安全性。Blank-TF的固有抗前鞭毛体活性可能源于脱氧胆酸钠的边缘活化剂作用。在体内实验中，IQ-TF以比市售5%乳膏低约30倍的药物浓度实现了相当的寄生虫控制效果，且与全身给药的脱氧胆酸盐两性霉素B效果相当。组织病理学改变提示IQ-TF不仅控制寄生虫，还调节局部炎症反应。从转化角度，IQ-TF的局部给药方式、10天短疗程等特点符合被忽视疾病药物研发倡议（DNDi）制定的皮肤利什曼病目标产品概况（TPP）要求。研究结论认为，转移体递送咪喹莫特通过增加感染部位局部药物可利用性改善了其治疗性能，以约30倍更低的药物浓度产生了与全身脱氧胆酸盐AmB相当的治疗反应，提示IQ负载转移体是治疗皮肤利什曼病的有前景的局部纳米平台。