《Microorganisms》：Cyclovirus-Related DNA in Bovine Feces from Northern Portugal: Molecular Detection and Phylogenetic Characterization
编辑推荐：
Cyclovirus（环状病毒属）是环状Rep编码单链DNA（circular Rep-encoding single-stranded DNA, CRESS-DNA）病毒，已在广泛的生物和环境样本中检出，但该属许多成员的自然宿主和生物学意义仍知之甚少。关于其
Cyclovirus（环状病毒属）是环状Rep编码单链DNA（circular Rep-encoding single-stranded DNA, CRESS-DNA）病毒，已在广泛的生物和环境样本中检出，但该属许多成员的自然宿主和生物学意义仍知之甚少。关于其在牛，尤其是粪便材料中的存在信息仍然有限。在本研究中，研究人员采用靶向复制相关蛋白（replication-associated protein, rep）基因保守区的巢式PCR（nested PCR）检测，对来自葡萄牙北部21个农场的100份牛粪样本进行了圆环病毒（circovirus）和Cyclovirus相关DNA筛查。扩增子通过双向Sanger测序和最大似然（maximum-likelihood）系统发育分析进行表征。在14/100份样本中检出Cyclovirus相关DNA，对应分子检出率为14.0%（聚类自助法95%置信区间[cluster-bootstrap 95% CI]：5.6–26.5%），阳性动物来自7/21个农场。获得的部分rep序列与Crocidura russula粪便相关Cyclovirus MAVG5（PQ576920）的核苷酸一致性为94.8–100%，其中5条序列与相应同源区完全一致。系统发育分析将所有牛源序列与MAVG5聚类于一个更广泛谱系中，该谱系包含Human-associated Cyclovirus 6。在考虑农场内聚类的探索性广义估计方程（generalized estimating equation, GEE）分析中，未观察到Cyclovirus检出与腹泻之间存在统计学显著关联（GEE：优势比[odds ratio, OR] = 0.76，95% CI：0.31–1.86；p = 0.549）。这些发现扩展了对家畜相关粪便材料中Cyclovirus相关DNA的当前认识，并提示伊比利亚半岛不同哺乳动物相关基质中存在密切相关的Cyclovirus序列。然而，仅在粪便中检出并不能确定牛为生物宿主或证明活动性感染。需要完整基因组表征以及更广泛的宿主和环境监测，以阐明这些病毒的分类学、宿主范围和生态学意义。
CRESS-DNA病毒（circular Rep-encoding single-stranded DNA viruses，环状Rep编码单链DNA病毒）是一类基因组为环状单链DNA、编码复制相关蛋白（replication-associated protein, Rep）的小病毒，分布于广泛宿主和环境生态位中，涵盖圆环病毒科（Circoviridae）等已识别病毒科。圆环病毒科分为Circovirus和Cyclovirus两个属，后者目前包含国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV）承认的90个种。Cyclovirus基因组约为1.7–1.9 kb，通常含有两个主要开放阅读框，分别编码Rep和衣壳蛋白（capsid protein, Cp）。Cyclovirus最初通过人类和非人灵长类粪便样本的病毒宏基因组研究发现，2010年在多个灵长类粪便和动物源性食品完整环状基因组表征后提出该属。此后，其在人类、非人灵长类、家畜、鸟类和节肢动物等多种生物样本中被检出，并见于粪便、血液、组织和环境样本。然而，许多Cyclovirus的实际宿主范围仍不确定，尤其在粪便材料中检出病毒DNA时，其存在可能反映饮食摄入、环境暴露或经胃肠道通过，而非采样宿主的主动感染。尽管致病潜力仍知之甚少，Cyclovirus DNA已在疑似急性中枢神经系统感染患者脑脊液、不明原因截瘫患者血清和脑脊液、发热性疾病、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染、社区获得性肺炎以及免疫抑制患者血液等临床相关场景中检出，但DNA检出不能确立与这些临床状况的因果关系，且尚未在人类细胞中确证复制。Human-associated Cyclovirus 6目前归入Cyclovirus mmadu种，包括毒株NG12（GQ404854），最初在尼日利亚一名非脊髓灰质炎急性弛缓性麻痹患者粪便中检出，但其与神经系统疾病的关系仍未知，且近缘Cyclovirus随后在其他动物相关样本中被发现，进一步凸显自然宿主和致病意义的不确定性。尽管Cyclovirus在不同动物种中日益受到认识，关于其在牛中的发生和遗传多样性仍有限。早期研究在牛组织检测到Cyclovirus相关序列，并表征了来自牛的完整基因组，包括与其他家畜物种中鉴定的Cyclovirus近缘的毒株，这提出了宿主特异性和跨种传播可能性的问题。然而，牛中Cyclovirus流行病学仍理解不足，关于其牛胃肠道存在和粪便排毒的信息也稀少。此外，在动物源性样本中检出Cyclovirus DNA并不必然确定采样物种为自然宿主，其牛中生物学意义仍未解决。因此，需要进一步分子和基因组研究以明确其在牛群体中的发生、遗传多样性和可能宿主关联。研究人员在本研究中调查了葡萄牙牛粪便样本中Cyclovirus DNA的发生，并对检出的病毒序列进行了分子和系统发育表征。尤其是，牛粪中Cyclovirus相关DNA可用分子数据有限，凸显了针对性监测研究在提供家畜相关粪便材料中病毒发生和系统发育关系基线信息方面的价值。
关键技术方法方面，研究人员使用2024年7月至9月间在葡萄牙北部Viana do Castelo区21个独立奶牛场便利采集的100份牛粪样本，每场采样1–15头动物，中位数3头，每头动物提供单份粪样，这些样本此前已用于肠道原虫调查。研究人员采用靶向rep基因保守区的巢式PCR筛查circovirus和Cyclovirus相关DNA，阳性扩增子经双向Sanger测序；采用BLASTn进行分类鉴定，MAFFT v7.526进行多序列比对，IQ-TREE v3.1.4以TIM2+F+I+G4模型进行最大似然系统发育重建，1000次超快自助法（UFBoot2）评估分支支持，iTOL v7.6可视化。分子发生率采用农场水平聚类自助法1000次估计95% CI；采用探索性单变量GEE二项logit模型，以农场为聚类变量并假设交换相关结构，评估Cyclovirus检出与腹泻的关联。
研究结果如下。3.1. Cyclovirus Detection and Molecular Occurrence：通过巢式PCR筛查100份牛粪样本，Cyclovirus相关DNA在14份中检出，总体分子发生率为14.0%（cluster-bootstrap 95% CI：5.6–26.5%），阳性动物来自21个采样农场中的7个，占33.3%；未检出circovirus相关序列。按年龄类别，成年牛为10/78（12.8%；95% CI：6.3–22.3%），青年母牛为1/5（20.0%；95% CI：0.5–71.6%），犊牛为3/17（17.6%；95% CI：3.8–43.4%）；由于部分年龄类别动物数有限，这些亚组比例应视为描述性。3.2. Sequence Characterization：双向Sanger测序获得14条适合分子表征和系统发育分析的Cyclovirus相关一致序列，质量修剪后长度为230–377 bp，均对应巢式PCR靶向的同一rep基因同源区。与Crocidura russula粪便相关Cyclovirus MAVG5参考序列（PQ576920）比较，分析的同源区核苷酸相似性为94.8%–100%；5条序列与PQ576920相应区域100%一致，其余序列一致性为94.8%–99.7%。3.3. Phylogenetic Analysis：最大似然系统发育分析将全部14条牛源序列与Crocidura russula粪便相关Cyclovirus MAVG5（PQ576920）置于一个密切相关的Cyclovirus谱系中，包含牛源序列和PQ576920的分支自助支持值为90.9%；该组与Human-associated Cyclovirus 6毒株NG12（GQ404854；Cyclovirus mmadu）聚类，较广谱系支持率为99.4%；相反，Bovine-associated Cyclovirus 1（HQ738634；Cyclovirus gaaye）占据一个不同且相对较远的系统发育谱系；高度相似牛源序列之间的内部关系总体显示较低自助支持。3.4. Association Between Cyclovirus Detection and Diarrhea：32头腹泻动物中3头（9.4%）为Cyclovirus相关DNA阳性，68头非腹泻动物中11头（16.2%）阳性；按年龄类别分布差异明显。成年牛中，17头腹泻动物均未阳性，非腹泻61头中10头阳性；犊牛中，15头腹泻动物中3头阳性，2头非腹泻犊牛均非阳性；5头青年母牛均无腹泻，唯一Cyclovirus阳性青年母牛为非腹泻。在考虑农场内聚类的探索性单变量GEE分析中，未观察到Cyclovirus检出与腹泻之间统计学显著关联（OR = 0.76，95% CI：0.31–1.86；p = 0.549）；鉴于阳性动物少及年龄类别与腹泻状态关系明显，该估计应谨慎解释，并可能受年龄混杂影响；由于Cyclovirus阳性动物有限、腹泻阳性动物少且腹泻在各年龄类别分布稀疏，未拟合年龄调整多变量模型，单变量GEE分析被视为探索性。
讨论部分总结：研究人员在100份牛粪中检出14份Cyclovirus DNA，部分rep基因序列与Crocidura russula粪便相关Cyclovirus MAVG5（PQ576920）高度相似，核苷酸一致性94.8%–100%，BLAST比较查询覆盖率为100%。MAVG5最初从西班牙Crocidura russula粪便中 recovered，完整基因组分析显示其与Human-associated Cyclovirus 6近缘；MAVG5与Human-associated Cyclovirus 6毒株RI46/ITA（MZ201304）核苷酸一致性为97.9%、查询覆盖率99%，全基因组两两比较一致性为89.2%。根据当前ICTV标准，Cyclovirus属成员完整基因组核苷酸一致性低于80%时归入不同种，因此MAVG5与Human-associated Cyclovirus 6被认为属于同种的变异株而非不同种。牛粪中Cyclovirus相关DNA检出在农场动物Cyclovirus发生知识仍有限背景下具有相关性；尽管在人粪以及牛、山羊、鸟组织等多种生物基质中检出Cyclovirus日益增多，家畜粪样中其发生和流行信息仍稀少。牛中知识缺口尤其明显：虽在牛粪中发现过多种CRESS-DNA病毒，但牛相关Cyclovirus主要在组织样本中检出，粪中发生和流行基本未探索；本研究报告14%（14/100）检出频率，提供Cyclovirus相关DNA在研究所涉牛群粪材中可能相对常见的证据。与既往牛研究直接比较困难，因为多数牛粪研究关注其他CRESS-DNA病毒而非Cyclovirus属成员。例如，Bo-Circo-like病毒曾在牛粪中检出，初检在腹泻动物中为5.3%（4/75），随后中国更大调查报告23.6%（205/868）牛中检出病毒DNA；但这些病毒与Cyclovirus遗传上不同，目前与Kirkoviridae谱系相关，因此其流行估计不能直接与本研究的14%检出频率比较，但说明牛胃肠道环境中可检出CRESS-DNA病毒多样性。尽管腹泻动物中Cyclovirus相关DNA检出频率低于非腹泻动物（9.4% vs. 16.2%），但聚类调整分析未发现与腹泻统计学显著关联；阳性动物有限及由此导致宽置信区间限制估计精度，因此无统计学显著性不应解释为不存在关联。重要的是，粪中Cyclovirus DNA检出本身不应解释为牛主动感染证据；粪样是复杂生物基质，含宿主来源以及饮食、环境、微生物和潜在寄生虫来源物质。同一批粪样此前筛查Giardia duodenalis，在6头动物中检出；14份Cyclovirus相关DNA阳性样本中仅1份同时为G. duodenalis阳性，表明两种检出重叠有限。该观察不能得出检出Cyclovirus相关DNA来源结论，但低共检提示其存在与采样动物G. duodenalis阳性并不一致相关。总体，100份牛粪中仅1份共检Giardia duodenalis和Cyclovirus相关DNA。对仅通过分子方法识别的CRESS-DNA病毒而言，宿主归属尤其困难，在胃肠道检出病毒序列不一定识别病毒复制所在生物；因此本研究结果证明牛粪中存在Cyclovirus相关DNA，但将牛确立为这些病毒生物宿主需要进一步证据。此外，尽管研究所用简并rep靶向检测设计用于广泛检测Cyclovirus和circovirus相关序列，但未鉴定到circovirus相关序列；这应解释为在所采用筛查条件下未检出，而非证明采样群体完全不存在。宿主归属不确定性尤其与本研究序列和MAVG5近缘有关，MAVG5最初在食虫哺乳动物Crocidura russula粪便中鉴定；高度相似Cyclovirus序列出现在系统发育较远哺乳动物粪样中，引发其实际宿主范围和生态起源问题。类似观察此前已有报道，包括从不同农场动物种恢复的近缘病毒基因组；例如，从山羊组织恢复的Cyclovirus被发现与牛相关Cyclovirus几乎相同，支持遗传相关Cyclovirus可能出现在不同动物种中，但在不同动物种样本中鉴定遗传相关病毒序列不一定确立这些动物为生物宿主或提供跨种传播证据。地理背景也值得注意：MAVG5在西班牙采集的C. russula粪便中鉴定，而此处近缘序列在葡萄牙北部牛中检出；近期对牦牛（Bos grunniens）粪便宏基因组分析也显示包括Circoviridae成员在内的CRESS-DNA病毒多样集合，进一步说明这些病毒在反刍动物相关粪病毒组中广泛存在。尽管现有数据不足以推断野生动物与家畜之间传播，但在邻国和不同哺乳动物相关基质中检出遗传相似序列，提示该Cyclovirus谱系在伊比利亚半岛的生态分布可能比目前认识更广；需要扩展监测，涵盖家畜、同域野生动物、环境样本和其他潜在宿主，以明确其分布和生态关联。研究局限包括：样本量相对有限、样本地理来源局限于葡萄牙北部牛场，限制14%检出频率外推至更广泛牛群体；横断面性质不能评估时间模式、持续性或间歇性检出；仅检查粪材，无配对血液或组织样本研究系统性存在或提供支持牛为生物宿主的进一步证据；未定量病毒载量，未尝试证明病毒复制或回收感染性病毒；病毒分离超出该分子研究范围，并因Cyclovirus属成员缺乏已建立细胞培养系统而更复杂，其确定宿主和复制生物学仍理解不足；缺乏提取空白和内部扩增对照，分别限制排除DNA提取污染和粪样PCR抑制的能力；虽包含遗传不同的circovirus阳性对照，但未测定检测对特定Cyclovirus谱系的分析灵敏度；Cyclovirus相关DNA阳性动物和阳性农场数相对较少，也限制关联估计精度，表现为宽置信区间。因此，本研究结果主要应解释为牛粪样本中Cyclovirus相关DNA存在的证据，而非牛主动感染或疾病证据。最后，本研究受限于仅表征rep基因部分区域；尽管该区域允许将检出序列与既往描述Cyclovirus比较并支持其系统发育位置，但部分rep序列不足以按当前ICTV标准进行确定性种级分类，该标准依赖全基因组核苷酸一致性。通过滚环扩增（rolling-circle amplification, RCA）后进行反向PCR或宏基因组测序恢复完整环状基因组，将有助于确定牛相关序列的精确分类位置、表征其基因组组织并建立其与MAVG5和Human-associated Cyclovirus 6的关系。
结论翻译：本研究在葡萄牙北部采集的牛粪样本中14%鉴定出Cyclovirus相关DNA，并发现所得部分rep序列与Crocidura russula粪便相关Cyclovirus MAVG5高度遗传相似。这些发现扩展了当前关于家畜相关粪便材料中Cyclovirus相关序列发生的知识，并突出在伊比利亚半岛不同哺乳动物物种粪便样本中检出遗传相似序列。然而，仅在粪便中检出不能确定牛为生物宿主或证明主动感染、复制或致病性。恢复完整病毒基因组，以及包括更多动物物种、组织、血液和环境样本的更广泛监测，将有必要阐明这些病毒的分类学、宿主关联、流行病学和生态学意义。
