草原来源耐草甘膦 Pseudomonas sp. ADL-13 与 Paenibacillus sp. ZHS-9：兼具植物促生特性与广谱非生物胁迫耐受性

《Microorganisms》：Steppe-Derived Glyphosate-Tolerant Pseudomonas sp. ADL-13 and Paenibacillus sp. ZHS-9 Strains with Plant Growth-Promoting Traits and Broad Abiotic Stress Tolerance

　　

将植物促生细菌（PGPB）整合到可持续农业实践中，是提高作物生产力和胁迫韧性的有前景策略。研究人员对两株新分离的草原来源耐草甘膦细菌 Pseudomonas sp. ADL-13 和 Paenibacillus sp. ZHS-9 进行了表征，评估了它们的体外（in vitro）草甘膦耐受性、植物促生（PGP）潜力和生态生理韧性。Pseudomonas sp. ADL-13 表现出体外草甘膦耐受性，在草甘膦浓度1.0–2.0 g/L时呈现显著的生长刺激。Paenibacillus sp. ZHS-9 在体外可耐受高达0.5 g/L的草甘膦而无显著生长抑制，同时在1.0和2.0 g/L浓度下保持可测定的生长。在小麦幼苗生物测定中，无细胞培养滤液促进了幼苗生长，而接种活菌培养物显著提高了生物量积累、幼苗生长和活力。植物促生（PGP）性状包括两株菌的磷（P）和钾（K）溶解、铁载体（siderophore）和氨（NH₃）产生；此外，在ZHS-9中检测到推定固氮潜力和类吲哚乙酸（IAA）吲哚化合物。两株分离菌还对盐、渗透和氧化胁迫以及pH和温度波动表现出广泛耐受性。兼容性测定显示ADL-13对ZHS-9具有拮抗活性，强调了评估菌株间相互作用的重要性。总之，这些发现表明ADL-13和ZHS-9是可用于农业应用进一步评估的潜在PGPB候选菌株。

全球农业系统正面临人口增长、土地退化和气候变化带来的多重压力，粮食安全成为重大挑战。草甘膦作为全球使用最广泛的广谱除草剂，在杂草管理中不可或缺，但其反复大量施用引发了抗性杂草演化、残留累积以及生态和人体健康方面的担忧。植物促生细菌（PGPB）能够通过生物固氮、溶磷、解钾、产生铁载体和植物激素、抑制病原菌以及缓解非生物胁迫等机制促进植物生长，被认为是减少化学投入、维持作物产量的可持续策略。草原土壤微生物长期经受剧烈的季节性温度波动和半干旱条件，可能蕴藏环境适应性强的有益菌，但相关研究仍不充分。研究人员从哈萨克斯坦北部Akmola地区种植春季软小麦的农田采集两份土壤样品，分离耐草甘膦细菌，并系统评估其草甘膦耐受性、植物促生潜力和生态生理适应性，以期获得可用于可持续农业的候选菌株。

研究共分离获得10株耐草甘膦细菌，分属Paenarthrobacter、Paenibacillus和Pseudomonas三个属。基于草甘膦耐受性和小麦幼苗促生效果的综合标准，选出Pseudomonas sp. ADL-13和Paenibacillus sp. ZHS-9进行深入分析。结果显示，ADL-13在1.0–2.0 g/L草甘膦下生长显著增强，ZHS-9可耐受0.5 g/L草甘膦并在更高浓度下维持可测生长；两株菌均能通过无细胞培养滤液和活菌接种促进小麦幼苗生长，并具备多种PGP性状和广泛的非生物胁迫耐受性。兼容性测试发现ADL-13对ZHS-9具有拮抗活性，提示构建菌群前必须验证菌株互作。这些发现表明两株菌是开发微生物接种剂或环境友好型生物肥料的潜在候选，为草原来源PGPB的挖掘提供了基础依据。

关键技术方法包括：从哈萨克斯坦Akmola地区两块种植春小麦（Triticum aestivum L.）的农田采集0–20 cm土壤样品（SW-1、SW-3），采用选择性平板直接分离和富集培养法，以含草甘膦的基础培养基筛选耐性菌株；通过16S rRNA基因测序并结合rpoB/rpoD（ADL-13）和gyrA（ZHS-9）序列进行系统发育分析；利用固体和液体培养评估草甘膦耐受性；采用小麦幼苗盆钵试验分别测定无细胞培养滤液和活菌培养物对萌发、根长、苗长、鲜质量和活力指数的影响；通过特定培养基和显色方法检测溶磷、解钾、产铁载体、产氨、产类IAA物质、推定固氮、有机酸分泌和生物膜形成等PGP性状；设置NaCl、PEG 6000、H₂O₂、Tween 80、温度、pH梯度及冷热休克实验评估生态生理韧性；采用琼脂板共培养法检测菌株间兼容性，并用扫描和透射电镜观察细胞形态。

3.1 草原环境中耐草甘膦菌株的分离与鉴定
通过选择性培养基从两份草原农业土壤中获得10株形态不同的耐草甘膦细菌。16S rRNA基因测序鉴定出Paenarthrobacter sp.（ZHS-4、ZHS-5、ZHS-6）、Paenibacillus sp.（ZHS-8、ZHS-9、AZ-1、AZ-2、AZ-3）和Pseudomonas sp.（ADL-13、ADL-20）。系统发育分析显示，ADL-13与环境中Pseudomonas物种聚在一起，未紧密关联已知致病类群；ZHS-9则属于Paenibacillus polymyxa物种复合群，该复合群主要由植物相关和植物促生细菌组成。因此将两株菌暂定为Pseudomonas sp. ADL-13和Paenibacillus sp. ZHS-9。

3.2 草甘膦耐受性
液体培养实验覆盖0.05–5.0 g/L草甘膦浓度。多数菌株在0.5 g/L下生长不受显著抑制；三株Paenarthrobacter在1.0 g/L下几乎完全受抑；Paenibacillus菌株在1.0和2.0 g/L下受抑但仍可测，其中ZHS-9表现最好；Pseudomonas菌株ADL-13和ADL-20在1.0和2.0 g/L下生长显著高于无草甘膦对照，并在5.0 g/L下仍维持可测生长。结果证实草甘膦耐受性具有种属和菌株依赖性。

3.3 小麦幼苗生物测定
3.3.1 无细胞培养滤液对小麦幼苗生长的影响
在无细胞培养滤液（CCF）实验中，仅ADL-13的CCF同时显著提高了鲜质量（相对水和培养基对照）；ZHS-9的CCF在苗长、总长和活力指数上呈现正向趋势，但未达显著水平。基于草甘膦耐受性和多生长指标的联合标准，ADL-13和ZHS-9被选作后续研究对象。
3.3.2 活菌培养物对小麦幼苗生长的影响
用活菌培养物接种小麦幼苗时，ADL-13显著提高了鲜质量、根长、总长和活力指数（相对两种对照），ZHS-9显著提高了苗长和总长，鲜质量相对水对照显著。活菌处理的效果强于对应的CCF，说明活菌细胞提供了超越细胞外代谢产物的额外促生作用。

3.4 植物促生特性
ADL-13能溶解磷酸氢钙、磷酸三钙和钾，产生铁载体（不同培养基中PSU为13.35–63.05）和氨（YEG中11.53 μM，蛋白胨水中26.43 μM），分泌有机酸并形成强生物膜；未检出类IAA物质和固氮能力。ZHS-9能溶解磷酸氢钙和钾，产生类IAA吲哚化合物（20.97 μg/mL），在YEG中产氨（8.31 μM）和铁载体（3.40 PSU），具有推定固氮能力（在无氮培养基上生长），形成生物膜，并表现出推定有机酸分泌（局部透明圈）。

3.5 生态生理特征
3.5.1 非生物胁迫因子耐受性及最适温度和pH范围
ADL-13在5 g/L NaCl时生长最大，20 g/L以上完全抑制；ZHS-9在20 g/L NaCl下仍保持生长，25 g/L下有残余生长。ADL-13在25–150 g/L PEG 6000下生长最佳，ZHS-9在25 g/L时最大。氧化胁迫方面，ADL-13在0.3 mM H₂O₂下仍可测，ZHS-9在0.3 mM下无显著抑制。两株菌对Tween 80均表现较强耐受，ADL-13在0.25–0.5%时反而受促进。温度方面，ADL-13最适15–30°C，ZHS-9最适25–35°C。pH方面，ADL-13最适7.85–9.98（偏碱性），ZHS-9最适7.23–7.85（中性至微碱性）。
3.5.2 热休克和冷休克测定
将菌悬液在-20至60°C下暴露5、30或60分钟后恢复培养，两株菌均能在-10°C至40°C的多种温度处理后恢复生长，而在-20°C和50–60°C处理后恢复显著下降，表明它们对温度骤变具有较强恢复能力。
3.5.3 定性兼容性测定
共培养实验显示ZHS-9对ADL-13无抑制作用，但ADL-13对ZHS-9表现出拮抗活性，因此两株菌不能组合为联合菌群，但仍可作为独立菌株用于生物肥料开发。该结果强调了在组装菌群前进行兼容性测试的必要性。
3.5.4 SEM/TEM
扫描电镜和透射电镜显示两株菌均为杆状，表面光滑、细胞壁完整，内部细胞质均匀，符合典型的Pseudomonas和Paenibacillus形态学特征。

讨论部分总结：研究人员指出，两株菌的草甘膦耐受性可能与其分离自具有反复草甘膦施用历史的农田土壤有关。PGP性状是在无草甘膦条件下测得的基线特征，尚需在草甘膦胁迫下进一步验证其表达稳定性。生态生理数据表明，两株菌对盐、渗透、氧化、温度和pH波动具有广泛适应性，这与草原环境剧烈的环境波动相吻合。兼容性结果表明，即使两株菌的PGP性状互补，拮抗关系仍会阻碍菌群构建，因此菌株间互作验证是必要的。结论翻译：草原来源Pseudomonas sp. ADL-13和Paenibacillus sp. ZHS-9表现出多种植物促生性状和环境胁迫韧性，包括耐受草甘膦和各种非生物胁迫。在小麦幼苗生物测定中，两株菌均显著促进了早期植物发育。两株菌均具有磷酸盐和钾溶解能力及生物膜形成能力，其中ADL-13表现出较强的养分溶解和铁载体产生能力，ZHS-9表现出推定固氮能力和类IAA吲哚化合物产生能力。它们耐受草甘膦和不利环境条件的能力，连同其植物促生活性，凸显了其作为可持续农业候选生物接种剂和开发环境友好型生物肥料的潜力。