单细胞分析揭示了胃癌淋巴结转移过程中淋巴结-肿瘤生态系统的重塑

《Cell Reports》：Single-cell analyses reveal lymph node-tumor ecosystem remodeling during lymph node metastasis of gastric cancer

　　### 研究亮点
- 单细胞分析和TCR分析揭示了胃癌淋巴结转移过程中的免疫重塑
- ILC3细胞在微转移淋巴结中富集，并促进早期肿瘤细胞定植
- PDGFC促进ILC3细胞产生AREG，通过AREG-EGFR轴促进肿瘤迁移
- CD24+肿瘤细胞表现出更强的转移潜能，并与ILC3细胞形成空间关联

### 摘要
胃癌（GC）是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，具有很强的淋巴结转移倾向。为了表征转移生态系，我们对来自30个原发肿瘤及其配对前哨淋巴结（SLN）的156,871个细胞进行了整合性的单细胞转录组学和T细胞受体分析，涵盖了从无转移状态到微转移和宏观转移状态的肿瘤及其SLN。我们发现淋巴结中富集的衰竭T细胞可能是肿瘤浸润的衰竭CD8+ T细胞的来源，并揭示了疾病进展过程中肿瘤相关巨噬细胞对淋巴结微环境的动态重塑。进一步研究表明，ILC3细胞通过AREG-EGFR轴促进微转移淋巴结中的促转移微环境，从而有利于CD24+肿瘤细胞的定植。总体而言，这些发现提供了肿瘤-淋巴结转移生态系的阶段性视图，并确定了胃癌中的潜在治疗靶点。

### 引言
胃癌是全球第五大常见恶性肿瘤，也是癌症死亡的第三大原因。胃癌患者的死亡率仍然很高，尤其是在晚期或转移病例中。由于肿瘤内淋巴管的特殊结构，肿瘤细胞倾向于转移到淋巴结组织，而肿瘤细胞向淋巴结的转移是转移性肿瘤的早期表现。肿瘤起源于恶性细胞与其微环境之间的相互作用。肿瘤微环境是一个复杂的生态系统，由多种免疫细胞、基质细胞、血管细胞和细胞外成分组成，它们在肿瘤的发生、进展和转移中发挥着关键作用。前哨淋巴结（SLN）在肿瘤转移过程中具有双重作用：一方面，SLN是抗肿瘤免疫的强大来源，因此是成功免疫治疗的潜在靶点；另一方面，SLN也是系统性免疫监视的储备库。然而，淋巴结转移的进展会促进SLN的免疫抑制性重塑，从而削弱系统性免疫监视。尽管淋巴结参与肿瘤扩散与不良预后和疾病进展密切相关，但其具体机制仍不完全清楚。因此，需要更深入地了解肿瘤细胞如何在淋巴结微环境中建立和适应，以及淋巴结免疫微环境在转移过程中如何发生重塑。

### 研究方法
通过scRNA-seq技术，我们系统地比较了不同转移状态下原发肿瘤与淋巴结之间的细胞组成，包括原发胃癌（PT）、淋巴结转移胃癌（MT）、正常淋巴结（NLN）、微转移淋巴结（MLN）和宏观转移淋巴结（MMLN）。结合基于T细胞受体（TCR）的谱系追踪和轨迹推断，揭示了T细胞在淋巴结和肿瘤组织中的动态迁移和分化特征。我们还发现ILC3细胞通过PDGFC驱动的AREG-EGFR信号轴在微转移淋巴结中促进促转移微环境，有利于淋巴道传播和CD24+肿瘤细胞的后续建立。这些发现共同提供了肿瘤-淋巴结转移生态系的阶段性视图，并确定了胃癌中的潜在治疗靶点。

### 结果
- 通过多部位scRNA-seq技术，我们阐明了胃癌的细胞复杂性，分析了13例晚期患者的30个样本中未分选的肿瘤细胞和配对SLN的细胞特征。
- 根据淋巴结状态，将原发胃癌样本分为PT（无淋巴结转移）或MT（有淋巴结转移），淋巴结转移与较差的预后显著相关。
- 临床特征方面，PT和MT患者在性别、T分期和MSI状态上相当，而N分期因淋巴结转移状态的定义而有所不同。我们总共注释了156,871个高质量的单细胞，根据典型标记物表达将其分为五大主要谱系，并使用CellTypist进行了进一步验证。
- 不同组织部位的微环境存在显著差异：SLN主要由B细胞和T细胞主导；PT中髓系细胞和纤维母细胞较多；MT含有丰富的浆细胞、肥大细胞和内皮细胞。MLN代表肿瘤扩散的早期关键阶段，标志着局部控制的初步突破和全身扩散的开始。
- 树突状细胞（DCs）和ILC3细胞是MLN的主要成分，可能参与淋巴结内的免疫重塑。
- 通过scRNA-seq数据的重新聚类（使用SciBet），我们预测了所有细胞簇的身份，揭示了淋巴结-肿瘤 resident 细胞群的差异以及肿瘤生长和侵袭引起的整体变化。

### T细胞在胃癌中的动态关系
- 通过无监督聚类，我们识别出六个CD4+细胞簇、四个CD8+细胞簇、一个γδT细胞簇和一个ILC3细胞簇。
- 这些常规T细胞簇被进一步划分为幼稚（TN）、中央记忆（TCM）、Th17样（TH17）、效应记忆（TEM）、衰竭前体（TPEX）、调节性（Treg）和衰竭（TEX）T细胞，每种类型具有不同的组织分布模式。
- TN细胞（T01、T02和T06）在SLN中富集并保持静息状态。与先前的研究一致，大多数免疫抑制性FOXP3+ Treg（T07）细胞、LAG3+衰竭CD8+细胞（T03）和γδT（T09）细胞主要位于PT和MT肿瘤部位。TH17样细胞（T08）在肿瘤中富集，尤其是在MT中；而CD4+GZMK+ TPEX（T04）和CXCR5+ TFH细胞（T05）主要位于SLN。
- 我们还发现CD8+ CCL5+ TEM细胞簇在肿瘤部位和宏观转移淋巴结中富集。此外，在所有样本中观察到高表达FOS和FOSB相关基因的细胞簇（T11）。

### TCR分析与单细胞转录组学的结合
- 结合TCR-seq和单细胞转录组学分析，我们在33,158个T细胞中鉴定出至少一对完整的α-和β-链；其中6,126个细胞（18.48%）含有重复的TCR，代表1,717个不同的克隆型。观察到大约25%的TCR克隆型在肿瘤和淋巴结之间共享，表明这两个部位之间存在显著的免疫连通性。
- 在不同解剖部位分析克隆丰度发现，PT中的克隆型扩展比例最高。在T细胞亚群水平上，T03、T04和T10簇在整个数据集中表现出较高的克隆型扩展模式。
- 应用STARTRAC指数定量评估T细胞动态，观察到肿瘤组织和淋巴结之间显著的TCR库重叠。尽管PT和MT之间保守的TCR克隆型数量没有显著差异，但这些淋巴结共享克隆型的扩展强度在PT中明显高于MT。
- 克隆细胞在单个簇内的存在表明相应T细胞亚型的迁移（STARTRAC-migr）。使用STARTRAC-expa指数量化了T细胞簇内的克隆扩展和迁移潜力，CD8+ T03_CD8_GZMB细胞在克隆扩展、迁移和转变方面表现出最高指数，这与先前的报告一致。
- TCR分析显示，TEM细胞在MT中的迁移能力较弱。

### 结论
本研究通过综合分析胃癌肿瘤微环境、T细胞群体特性和潜在功能，为理解转移进程提供了宝贵的资源，并为针对淋巴结相关肿瘤扩散的治疗策略的发展提供了指导。同样，在我们的数据集中，GZMK+ TPEX（T04）显示出更大的倾向转变为TEX细胞（T03）（图2I；图S6C）。由于GZMK+ TPEX细胞主要富集在LN中，它们转变为肿瘤富集的簇（如TEX和CCL5+ TEM）可能伴随着跨组织迁移。因此，我们检查了GZMK+ TPEX（T04）与TEX（T03）或CCL5+ TEM（T10）之间的TCR共享情况，观察到肿瘤驻留的TEX（T03）和CCL5+ TEM（T10）细胞与LN来源的GZMK+ TPEX（T04）共享更多的TCR克隆，而与组织间的对应细胞相比（图2J）。这些发现表明，LN来源的GZMK+ TPEX细胞是肿瘤浸润T细胞的重要储备库，这些T细胞进一步分化为GZMB+ TEX或CCL5+ TEM表型。此外，淋巴结中的GZMK+ TPEX细胞与肿瘤中的GZMB+ TEX或CCL5+ TEM细胞在PT中的TCR重叠度更高（图2K），这表明LN来源的GZMK+ TPEX细胞在MT中的迁移受到抑制。最后，我们检查了LN来源的TPEX（T04）与肿瘤来源的TEX和TEM群体之间的保守TCR，以确认PT中LN TPEX和肿瘤TEX之间的高连通性（图2L）。

在所有CD4+ T细胞簇中，T07_CD4_FOXP3调节性T细胞群体在肿瘤部位和MMLN中显著富集，表明在晚期转移淋巴结中积累了免疫抑制性CD4+ T细胞。相比之下，T08_CD4_ANXA1亚群在MT中选择性地富集（图2B；图S7A）。伪时间分析将T08_CD4_ANXA1定位为CD4+ T细胞轨迹中的下游分化状态（图S7B）。值得注意的是，随着肿瘤进展，T08_CD4_ANXA1细胞的CCL20表达逐渐增加，细胞-细胞相互作用分析显示在MT中存在显著的CCL20–CCR6相互作用，表明MT中的免疫抑制信号增强（图S7C和S7D）。多重免疫组化（mIHC）证实了MT组织中表达CCL20的FOXP3+ CD4+ T细胞的积累，验证了这种免疫抑制性CD4+ T细胞群体的存在（图S7E）。对CD4+ T细胞也进行了类似的TCR克隆分析，以量化它们的组织分布和TCR共享情况。与CD8+ T细胞不同，CD4+ T细胞的克隆扩增总体较低。在这些簇中，T05_CD4_CXCR5（TFH）细胞表现出最高的克隆扩增、迁移和转化指数（图S6D）。此外，基于TCR共享和TFH（T05）、Treg（T07）和TH17-like（T08）之间共享的TCR模式的成对转化分析也表明TFH细胞与Treg和TH17-like细胞有关（图S7F）。然后，与CD8+ T细胞一致，TCR库分析显示肿瘤与PT中的淋巴结共享了更多的CD4+ T细胞克隆，表明淋巴结转移后肿瘤-淋巴结T细胞克隆间的连通性减弱（图S7G）。通过整合单细胞转录组和TCR数据，我们确定了从淋巴结到肿瘤部位的T细胞动态。我们发现，LN富集的CD8+ GZMK+ T细胞可能是肿瘤浸润淋巴细胞的潜在重要来源，包括CD8+ TEX细胞，尤其是在PT中。而LN来源的GZMK+ TPEX细胞在MT中的迁移受到抑制。这些结果表明，LN可能在T细胞浸润过程中塑造GC的TME中起潜在作用。

对于髓系细胞，无监督聚类分别识别出六个具有不同基因特征的簇（图3A）。DC亚群进一步被分类为CD1C/CLEC10A+ DCs（M05_cDC2）、CLEC9A+ DCs（M06_cDC1）和LAMP3+ DCs（M01_cDC3）。值得注意的是，LAMP3+ DC簇被归类为“mregDC”，因为它具有高水平的成熟和免疫调节标记物CCR7、CCL19和LAMP3——这些是肿瘤抗原摄取后诱导的状态特征（图S3C）。重要的是，LAMP3+ DCs在转移性淋巴结中优先富集，特别是在微转移性淋巴结中。LAMP3+ DCs表现出高水平的共刺激分子表达，包括CD40、ICOSLG和CD80，同时显示出免疫检查点相关基因（如PDCD1（PD-1）、PDCD1LG2（PD-L2）和NECTIN2）水平的升高，这些基因与免疫调节功能相关，可能表明它们具有调节T细胞反应的潜力（图S8A）。与正常淋巴结相比，肿瘤浸润的淋巴结中LAMP3+ DCs与T细胞之间的相互作用增强（图S8B）。细胞-细胞相互作用分析预测LAMP3+ DCs与T细胞通过CCL17/22–CCR4、CCL19–CCR7和CD86–CTLA4信号轴在肿瘤组织中的增强通信，表明它们在塑造T细胞招募和免疫调节中的潜在作用（图S8C）。先前的研究表明，LAMP3+ DCs可能与调节性T细胞的招募和某些肿瘤环境中CD8+ T细胞介导的抗肿瘤反应的减弱有关。这可以解释为什么在宏观转移性淋巴结中LAMP3+ DCs和Treg细胞的富集指数高于LN（图3B）。常规DCs，CLEC10A+ cDC2和CLEC9A+ cDC1，在淋巴结和PT中富集，但在MT中减少，反映了免疫微环境的变化。值得注意的是，cDC1表现出免疫调节基因（如LAG3和IDO1）的高表达（图S8A），表明它们具有通过代谢相互作用向cDC2s传递免疫抑制的潜力。总体而言，我们的数据表明LAMP3+ DCs是一种与转移相关的树突状细胞状态，可能参与重塑转移性淋巴结中的T细胞相关免疫环境。

图3 显示了淋巴结肿瘤转移过程中髓系景观的动态重塑

(A) 6个髓系簇的UMAP投影，按簇着色。
(B) 热图显示了每个髓系细胞簇的组织特异性。顶部条形图显示细胞组成，右侧条形图显示组织组成。
(C) 4个基因特征分数在髓系簇中的表达水平。中心线表示中值；下限和上限分别代表第25和第75百分位数， whiskers表示四分位数范围的1.5倍。
(D) 通过DEseq2识别出伪批量表达模块，以及M03_TAM_C1QA的发展。
(E) 小提琴图显示了来自LN、MLN和MMLN的M03_TAM_C1QA细胞中选定基因的表达水平。
(F) 在肿瘤进展的淋巴结中M03_TAM_C1QA细胞的富集途径。p值通过Benjamini-Hochberg方法进行了调整。
(G) 反转图显示了LN、MLN和MMLN中TF的交集。
(H) 热图显示了代表性TF的活性。行代表TF，列代表不同状态的淋巴结。

在肿瘤晚期，肿瘤和淋巴结中占主导地位的免疫抑制性单核细胞/巨噬细胞亚群

对于单核细胞/巨噬细胞亚群，肿瘤富集的簇被鉴定为IL1B+单核细胞，而基于C1QA（B/C）的表达，鉴定出LN富集的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）（图3A；图S3C）。单核细胞在肿瘤免疫中扮演复杂甚至矛盾的角色。在这项研究中，M02_Mono_CXCL8簇在不同肿瘤状态中表现出不同的功能状态。在PT中，M02细胞表现出促炎表型，其特征是IFITM2的表达和JAK-STAT信号通路的激活。相反，在MT中，这些细胞经历了向应激抗性和免疫抑制状态的显著重编程，其特征是热休克蛋白（如HSPA1A、HSP90AA1）的高表达以及向氧化磷酸化的代谢转变（图S9A–S9E）。总体而言，这些发现表明转移微环境将单核细胞的可塑性重塑为免疫抑制性和支持肿瘤的状态。

M03_TAM_C1QA代表一种肿瘤相关巨噬细胞（TAM）状态，其特征是免疫调节巨噬细胞标记物（包括MRC1和CD163）的高表达，并主要富集在转移性淋巴结（MLN/MMLN）中（图3B；图S9A和S9B）。为了描绘C1QA+ TAM在LN状态之间的动态转变，我们进行了跨LN状态的伪批量差异表达分析。似然比测试（LRT）识别出四个具有状态特异性表达模式的不同的转录模块（Module1–Module4）（图3D）。Module2在NLN中富集，其特征是维持淋巴结内巨噬细胞稳态的标志物TPT1和KLF4（图3E）。值得注意的是，M3在MLN阶段达到峰值，并富集了NFE2L2（NRF2），表明对早期转移微环境的早期抗氧化反应。功能富集显示从LN中的先天免疫感应（如TLR/RIG-I信号）向转移状态中的氧化磷酸化、RNA剪接和TNF-α信号的逐步转变，反映了代谢和炎症的重编程（图3F）。SCENIC分析确认了基因调控网络的全面重连，其中从LN到MLN/MMLN的转变由激活的调控子（如SPIC、MAF和CEBPA）驱动（图3G和3H）。为了确定这一转变的外部驱动因素，NicheNet分析预测转移微环境配体（包括IFNG、IL6和OSM）优先诱导目标基因（如APOE、HLA-B和B2M）（图3I；图S9F）。这些发现共同表明，C1QA+ TAMs在从淋巴oid稳态到转移的转变过程中经历了显著的功能和调控重编程，反映了不同淋巴结状态之间的不同转录程序的参与。

我们在PT和MT中识别出了七种B细胞簇，包括天真（B01）、记忆（B02, B03）细胞、热休克蛋白（HSP）相关（B04）细胞、浆细胞（B05）、生发中心（GC）B细胞（B06）和增殖B细胞（B07）（图4A）。天真和记忆B细胞主要局限于淋巴结，表明处于静止状态，而GCB和其他生发中心相关细胞在PT中相对富集，表明局部免疫激活更强（图4B和4C）。浆细胞（B05）表现出不同的功能程序：PT中的浆细胞上调激活和抗体分泌基因（TPT1、TMSB4X、EEF1A1、EEF2、ELL2、PRDM1），并主要表达IgG（IGHG1、IGHG4），反映了强大的体液免疫；相比之下，MT中的浆细胞表达热休克蛋白（HSPA1B、DNAJB1）和BAG3，并富集IgA（IGHA1、IGHA2），表明压力适应和局部免疫重塑（图4D和4E）。趋化因子受体分析显示PT中的浆细胞富集CXCR4和CCR2，支持向免疫活性微环境的迁移，而MT中的浆细胞上调CCR10，这与先前在结直肠癌肝转移中的发现一致，即IgA+浆细胞通过CCR10–CCL28信号途径被招募，这种机制也在转移性胃癌中观察到。细胞-细胞相互作用分析进一步表明，PT的基质通过CCR2–CCR2轴招募IgG+浆细胞，突出了特定微环境和非免疫细胞在转移过程中如何塑造体液免疫（图4F和4G）。

图4 在两个肿瘤部位中B细胞和成纤维细胞表型的特征

(A) 7个B细胞簇的UMAP投影。
(B) 热图显示了每个B细胞亚群的组织特异性，由Ro/e分数估计。顶部条形图显示细胞组成，右侧条形图显示组织组成。
(C) 山脊图显示了肿瘤微环境中三级淋巴结构（TLS）成分的比例。
(D) PT和MT之间浆细胞的差异表达基因。基因，p值< 0.05，双侧Wilcoxon检验通过BH程序调整；log 2（倍变化）> 0.8。
(E) 小提琴图显示了PT和MT中代表性基因的表达。
(F) 点图显示了PT和MT中选定基因的表达模式。
(G) Circos图显示了PT中选定的配体-受体对的平均相互作用强度，按每个簇着色。
(H) 4个成纤维细胞簇的UMAP投影。
(I) 热图显示了每个成纤维细胞亚群的Ro/e分数估计的组织特异性。顶部条形图显示细胞组成，右侧条形图显示组织组成。
(J) 成纤维细胞的scVelo分析。每个点代表一个成纤维细胞簇。
(K) S2_CAF_CXCL14和S3_CAF_SFRP2之间的差异表达基因。基因，p值< 0.05，双侧Wilcoxon检验通过BH程序调整；log2（倍变化）> 0.8。
(L) 基因本体（GO）富集分析。Benjamini-Hochberg（BH）调整后的p值< 0.05的途径被认为是显著富集的。

我们在胃癌中识别出四个基质簇，包括三个成纤维细胞亚群（S2–S4）和一个周细胞簇（S1）。S2_CAF_CXCL14簇主要富集在MLN/MMLN和MT中，而S3_CAF_SFRP2富集在PT中（图4H和4I）。轨迹分析显示S2_CAF_CXCL14和S3_CAF_SFRP2之间的转录状态不同（图4J）。S3_CAF_SFRP2表现出更高的补体相关基因表达，包括C3、C7和CFD，这与先前的报告一致，表明补体激活有助于EMT、迁移、化学抗性和免疫逃逸在GC进展中的作用（图4K）。相比之下，S2_CAF_CXCL14在MT中优先富集，并表现出细胞外基质（ECM）相关途径的激活增加，包括细胞-细胞粘附、血管发育和伤口愈合的调节（图4L）。这些发现表明，S2_CAF_CXCL14可能代表一种与转移相关的基质状态，其特点是与淋巴结微环境的相互作用增强，这暗示它可能参与转移微环境的重塑。ILC3在转移性淋巴结中富集，并通过PDGFC-AREG信号轴促进肿瘤细胞的定植。为了阐明胃癌转移期间淋巴结免疫景观的重塑过程，我们观察到在肿瘤细胞入侵后，第3组先天淋巴细胞（ILC3）在淋巴结中显著富集（图5A–5C），且ILC3在转移性淋巴结（MT）中的频率高于原发性淋巴结（PT）。ILC3在胃肠道黏膜免疫中的作用复杂且取决于具体情境。最近的研究表明，ILC3的扩增可以促进肿瘤生长的微环境。为了进一步验证这些发现，我们使用mIHC染色分析了11名淋巴结（6例NLN，2例MLN，3例MMLN）患者的样本（图5D；图S10A–S10C）。mIHC图像的量化结果显示，MLN样本中的ILC3数量多于NLN和MMLN样本（图5E；表S7）。SCENIC分析确定BCL11A是ILC3中的主要调控因子，它可能有助于抑制屏障组织中的过度炎症。除了经典的ILC3标记物KIT和IL7R外，这一亚群还表现出高水平的MHC II类（HLA-DRA）和CCR6，以及LAIR1和上皮生长因子AREG（图5F）。重要的是，MHC-II+ CCR6+ ILC3通过抑制共生特异性和致病性T细胞反应来促进免疫耐受。AREG是一种组织保护因子，支持上皮修复和屏障完整性。淋巴结中的ILC3表达高水平的AREG，可能通过与肿瘤细胞和成纤维细胞上的EGFR相互作用，促进肿瘤细胞的定植（图S9D）。值得注意的是，我们确定了驱动ILC3表达的调控因子。具体来说，BCL11A、PBX1、CUX1和SPI1被预测为ILC3的激活因子（图5G）。为了探索ILC3的潜在调控因子，我们应用了NicheNet，该工具确定了PDGFC和NOG为最可能的候选因子（图5H），提示它们可能参与ILC3的调控。此外，我们利用癌症基因组图谱（TCGA）的数据研究了ILC3活性与胃癌进展之间的关系。我们观察到，根据TCGA表达谱定义的ILC3关键基因（AREG、SPINK2、LINC00299、KIT、SCN1B、LST1、SOX4、TYROBP、TMIGD2、IL7R）表达较高的患者，其病理分期和肿瘤分级显著更高（图S10E和S10F）。此外，PDGFC表达升高与不良临床结果相关，表明它可能作为胃癌的预后生物标志物（图5I）。一致地，ILC3活性评分也将患者分为不同的生存组，进一步突出了ILC3相关调控程序的临床重要性（图5J）。ILC3作为黏膜先天淋巴细胞，参与对外来细菌的先天免疫反应。鉴于幽门螺杆菌（H. pylori）是胃癌的已知致癌因子，我们进一步研究了H. pylori感染与ILC3活性之间的关系。H. pylori阳性的患者表现出显著升高的ILC3活性，提示细菌感染可能与促进肿瘤的ILC3反应有关（图S10G）。这些发现在校正后的独立微阵列队列中也得到了验证（图S10H），进一步支持ILC3在促进肿瘤进展中的潜在作用。

图5 ILC3促进肿瘤细胞在淋巴结中的定植
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图示说明：
(A) 面积图显示了不同淋巴结中T细胞和ILC3细胞类型的组成。
(B) 胃癌（GC）和淋巴结（PT = 5，MT n = 8，LN n = 5，MLN n = 8，MMLN n = 4）中ILC3的频率。中线表示中位数；下限和上限分别代表第25和第75百分位数，须状线表示四分位间距的1.5倍。统计显著性使用双侧非配对Wilcoxon检验进行评估，p值使用Benjamini-Hochberg（BH）方法进行调整。
(C) 小提琴图显示了标记基因和功能分子在各种淋巴细胞类型中的表达。
(D) mIHC显示了LN、MLN、MMLN中的CD3-RORγt+ ILC3细胞。刻度尺，左侧100 μm，右侧25 μm。
(E) 量化了LN、MLN、MMLN（LN n = 14，MLN n = 9；MMLN n = 9）ROI区域内的CD3-RORγt+ ILC3细胞密度。统计显著性使用Kruskal-Wallis检验后进行Dunn的多重比较检验，并采用Benjamini-Hochberg校正。每个点代表一个独立的生物学重复。数据以均值±SEM表示。调整后的p值如下：ns，无显著性；? p < 0.05，?? p < 0.01，??? p < 0.001。
(F) 山脊图显示了ILC3中代表性基因的表达。
(G) 散点图显示了ILC3中调控因子的特异性评分。
(H) NicheNet配体-靶标矩阵热图表示预测的TME中的优先配体与ILC3中靶标基因之间的调控潜力。按预测的配体-靶标调控潜力着色。
(I) KM生存分析显示了根据TCGA队列中PDGFC表达分层的胃癌患者的总生存期（OS）。
(J) KM生存分析显示了根据TCGA队列中ILC3特征基因组中的ILC3活性评分分层的胃癌患者的总生存期（OS）。
(K) 代表性mIHC图像显示了转移性淋巴结中PDGFC表达细胞与ILC3（CD3?RORγt+细胞）的空间关联。刻度尺，25 μm。
(L) RT-qPCR分析了IL-1β和IL-23刺激下ILC3中的AREG表达，无论是否添加重组PDGFC。数据以均值±SEM表示。统计显著性使用双侧非配对学生t检验进行评估。
(M) 代表性透膜迁移实验（Transwell）图像显示了ILC3刺激条件对MFC肿瘤细胞迁移的影响。MFC细胞与IL-1β/IL-23、IL-1β/IL-23加PDGFC或IL-1β/IL-23加AREG中和抗体AR37共同培养。刻度尺，50 μm。
(N) 量化了Transwell实验中迁移的MFC细胞数量。PDGFC刺激的ILC3增强了肿瘤细胞的迁移，而AREG的阻断则减弱了这种效应。数据以均值±SEM表示。统计显著性使用Kruskal-Wallis检验后进行Dunn的多重比较检验，并采用Benjamini-Hochberg校正。每个点代表一个独立的生物学重复。

为了进一步验证PDGFC对ILC3的调控作用，我们使用mIHC研究了它们的空间关系，发现PDGFC表达细胞与ILC3在淋巴结微环境中的紧密空间邻近性（图5K）。体外用重组PDGFC刺激ILC3进一步证明了PDGFC诱导了ILC3中的AREG表达（图5L）。功能性研究表明，PDGFC刺激的ILC3增强了肿瘤细胞的迁移，而这一效应在AREG抑制下几乎消失，表明ILC3介导的肿瘤细胞迁移依赖于PDGFC-AREG轴（图5M）。

为了研究ILC3在肿瘤侵袭和淋巴结转移中的功能贡献，我们使用了胃癌转移的小鼠模型。小鼠的脚垫单侧接种了MFC胃肿瘤细胞系，并在注射后第0天、第7天和第15天收集引流的腘淋巴结。随着时间的推移，淋巴结体积逐渐增加（图6A–6C），这与转移进展一致。mIHC显示CD3?RORγt+ ILC3在引流淋巴结中的动态积累。值得注意的是，ILC3的绝对数量在第7天达到峰值，随后在第15天显著下降（图6D）。这种减少与皮质区被大量的角质蛋白阳性肿瘤细胞替代相吻合，表明ILC3的招募是一个早期且短暂的事件，发生在明显的转移定植之前。为了直接评估ILC3对淋巴结定植的贡献，我们建立了脚垫肿瘤模型，并结合ILC3的过继转移来评估ILC3数量的增加是否促进肿瘤在引流淋巴结中的定植（图6E）。ILC3转移后，腘淋巴结的大小和ILC3的数量在第3天增加（图S11）。在第7天，接受ILC3转移的小鼠与对照组小鼠相比，肿瘤细胞在淋巴结中的扩散更为明显，表明ILC3的富集有助于早期淋巴系统中的定植（图6F）。总体而言，这些发现支持ILC3在促进胃癌肿瘤细胞在哨兵淋巴结中的初始定植中的潜在作用。

图6 验证ILC3在小鼠模型中淋巴结转移中的作用
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图示说明：
(A) 小鼠胃癌淋巴结转移模型示意图。小鼠的脚垫注射了鼠源胃肿瘤细胞系MFC，并在C57BL/6小鼠的第0天、第7天和第15天分析了腘淋巴结中的ILC3。
(B) 处死后切除的腘淋巴结的宏观图像。
(C) 终点时腘淋巴结大小的量化。数据代表小鼠的平均值±标准差。
(D) mIHC显示了第7天和第15天的CD3、RORγt和Keratin，以区分ILC3细胞和肿瘤细胞。刻度尺，左侧50 μm，右侧25 μm。
(E) 小鼠胃癌淋巴结转移模型和过继转移的示意图。小鼠的脚垫注射了鼠源胃肿瘤细胞系MFC，并在第三天和第七天分析了腘淋巴结中的ILC3。
(F) 携带MFC肿瘤的小鼠的腘淋巴结代表性mIHC图像，包括是否有ILC3的过继转移。切片染色显示DAPI、CD3、RORγt和Keratin。刻度尺，左侧50 μm，右侧25 μm。
(G) 使用ImageJ量化了指定组中的Keratin荧光强度。数据以均值±SEM表示。每组n = 6个切片。统计显著性使用t检验确定；p = 0.0018。

CD24高表达的恶性细胞定义了一种与淋巴结扩散相关的肿瘤状态
在胃癌上皮细胞中，原发性淋巴结（PT）表现出明显的转录异质性，而转移性淋巴结（MT）在患者间具有更高的相似性。功能上，PT细胞倾向于表现出脂质代谢程序的富集，而MT细胞则以氧化磷酸化相关通路为特征，这表明伴随淋巴结扩散发生了代谢转变（图S12）。为了表征与淋巴系统扩散相关的上皮细胞状态，我们重新聚集了具有匹配原发肿瘤和转移性淋巴结的恶性上皮细胞。UMAP确定了七个转录上不同的簇（C0–C6；图7A）。在这些簇中，C2在转移性淋巴结（MLN/MMLN）中的富集程度高于原发肿瘤（图7B和7C）。值得注意的是，C2细胞在12名患者中的10名中被检测到，表明这种上皮状态在患者间具有广泛的保守性。为了确定C2是否代表一种淋巴结特异性的群体或预先存在的肿瘤细胞状态，我们进一步分析了所有可用样本中的上皮细胞，包括无淋巴结转移的原发肿瘤。C2细胞在多种肿瘤环境中一致存在，并且也存在于没有淋巴结转移的原发肿瘤中，表明C2代表了一种在淋巴结定植期间可能被优先选择的上皮状态（图S12D–S12F）。在单基因水平上，C2特征性地表达免疫调节分子CD24、“别吃我”信号CD47、基质重塑蛋白酶MMP7、RAS家族 oncogene KRAS和干扰素诱导的限制因子IFITM3（图7D）。基因集富集分析进一步显示，C2细胞上调了致癌MYC通路以及更广泛的免疫反应通路（图7E）。一致地，连续淋巴结切片的mIHC分析显示ILC3和CD24+肿瘤细胞在淋巴结微环境中的空间邻近性（图7F）。总体而言，这些数据定义了一种在淋巴结定植过程中可重复选择的CD24高表达的促转移肿瘤亚克隆。

图7 转移性淋巴结中出现CD24+肿瘤细胞
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图示说明：
(A) 转移患者上皮细胞亚群的UMAP可视化。
(B) 条形图显示了不同部位中的细胞组成。
(C) 条形图显示了样本和组间C2上皮细胞的丰度。
(D) 点图显示了转移患者上皮簇中主要标记基因的表达水平。
(E) 通过BH方法调整p值后，GO、KEGG和Hallmark通路（p < 0.05）。
(F) 连续淋巴结切片的mIHC显示了ILC3和CD24+ keratin+上皮肿瘤细胞之间的空间关联。刻度尺，左侧100 μm（中间），右侧25 μm。

讨论
胃癌是一种侵袭性很强的恶性肿瘤，通常伴有淋巴结受累和广泛的转移。我们的研究提供了肿瘤和淋巴结在转移过程中免疫生态系统的综合视图。淋巴结富集的GZMK+ TPEX细胞作为中间前体，连接了幼稚T细胞、效应记忆T细胞和耗竭的CD8+ T细胞，它们迁移到肿瘤中以补充TEX和CCL5+ TEM群体，而在晚期转移中这种重叠减少，表明迁移受到损害。此外，巨噬细胞的重新编程和ILC3的积累改变了淋巴结微环境，使其趋向于促进转移。ILC3可能通过AREG-EGFR轴促进转移性种子形成，我们的观察还表明，幽门螺杆菌除了在肿瘤发生中的作用外，还可能通过调节与ILC3相关的程序与转移有关。此外，已经显示肿瘤微环境（TME）中的巨噬细胞具有高度异质性，在这种背景下，TAMs表现出显著的功能可塑性，具有促进或抑制肿瘤的不同状态。我们的数据揭示了巨噬细胞状态在转移级联过程中的逐步变化，从NLN（淋巴结）到MLN（次级淋巴结）再到MMLN（三级淋巴结），从促炎免疫监视状态向促肿瘤生长的微环境相关状态转变。特别是，LN巨噬细胞群体获得了与免疫调节和肿瘤细胞招募相关的支持肿瘤的特征。这些发现扩展了之前对巨噬细胞异质性的描述，表明淋巴结转移伴随着髓系成分的空间和功能重编程，从而建立了可能促进肿瘤扩散的转移微环境。总体而言，我们的研究提供了关于淋巴结如何积极促进胃癌（GC）中肿瘤免疫生态系统重建的见解。与之前主要关注原发肿瘤的胃癌scRNA-seq研究不同，我们的工作提供了一个全面的哨兵淋巴结单细胞图谱，揭示了淋巴扩散过程中的早期免疫重塑。我们鉴定出在LN中富集的、耗竭的CD8+ T细胞群体，这些细胞可能作为补充最终耗竭的肿瘤浸润细胞的储备库，这与其他实体瘤中的最新观点一致。我们纳入了处于不同转移阶段的淋巴结，并进一步使用TCR分析来揭示淋巴细胞和肿瘤成分之间的相互作用，扩展了Salehi等人的发现。此外，我们证明肿瘤相关巨噬细胞经历了逐步的转录重编程，将淋巴结微环境重塑为一个有利于转移的微环境。值得注意的是，微转移淋巴结中ILC3细胞的存在表明还有一个额外的先天免疫回路有助于促转移“土壤”的形成。ILC3可以通过细菌或真菌信号扩增，并在胃肠道中发挥关键作用，但大多数研究主要集中在肠道上，对胃的研究较少。在这里，我们的发现表明幽门螺杆菌感染可能与胃癌中ILC3活性的增加有关。这表明，像肠道一样，微生物信号可以影响胃中的ILC3功能，创造一个有利于早期转移的微环境。我们的发现提示了一种微生物-免疫机制驱动胃癌进展，并将ILC3确定为潜在的治疗干预靶点。

研究的局限性包括缺乏小鼠的胃哨兵淋巴结；因此，我们采用了足垫-腘窝淋巴结转移模型进行功能验证。此外，该模型减少了其他转移途径（如腹膜和血行传播）的干扰，并允许相对方便地监测淋巴结转移。未来的工作结合空间方法和ILC3-AREG-EGFR通路的机制扰动将对于确定针对胃癌淋巴结转移的治疗机会非常重要。总体而言，我们的研究提供了胃癌微环境的详细图谱，并揭示了淋巴结和肿瘤之间的动态相互作用。通过阐明肿瘤进展的关键细胞驱动因素，我们识别出了可以作为转移预测标志物的特定免疫亚群。重要的是，我们强调了ILC3作为淋巴结微环境的关键调节因子，这对早期转移扩散和治疗靶向具有潜在意义。这些见解提高了我们对胃癌生物学的理解，并揭示了增强抗肿瘤免疫和改善治疗结果的有希望的途径。

**研究的局限性**
这项研究有几个局限性。首先，目前没有一种完全再现胃癌哨兵淋巴结转移的解剖和生物学特征的小鼠模型；因此，本研究中使用的足垫-腘窝淋巴结模型无法完全再现胃癌淋巴转移的临床背景。其次，缺乏高度特异性的ILC3耗竭抗体或其他选择性清除体内ILC3的具体方法，限制了我们直接评估ILC3对淋巴结转移的具体贡献的能力。

**资源可用性**
更多关于资源和试剂的信息及合理请求应联系相应的作者：[e-mail]（Y.Y.）、[e-mail]（J.Z.）、[e-mail]（D.T.）。

**材料可用性**
本研究没有生成新的、独特的试剂。

**数据和代码可用性**
本研究中生成的单细胞RNA-seq（scRNA-seq）和单细胞TCR-seq（scTCR-seq）数据已存放在访问号GSA-Human: PRJCA036458下。先前发布的微阵列数据集来自TCGA，访问号为GEO: GSE5081。所有在本研究中使用的分析代码已存放在Zenodo上：https://doi.org/10.5281/zenodo.22655264。

**致谢**
我们感谢北京友谊医院实验动物中心提供的动物护理。这项工作得到了北京研究病房卓越计划（BRWEP2024W162020100、BRWEP2024W162020112、BRWEP2024W162020114）、国家自然科学基金（82171823、82300646）、国家重点技术研发计划（2015BAI13B09）、北京新星计划（编号20240484501）、北京自然科学基金（7232035、7232334）、非传染性慢性病-国家科技重大项目（2024ZD0520600）、北京市医院管理中心孵化计划（PX2020001、PX20240103）、首都健康改善与研究资金（2024-2028）、北京市科学技术委员会AI+健康协同创新培育计划（Z241100007724004）、医学创新与转化卓越计划（YC202401QX0824）以及北京市医学会临床研究资助计划（ZHKY-2025-1869（B012）的支持。

**作者贡献**
概念化：D.T
方法学：Y.Z.、B.L
调查：Y.Z.、Z.W.
资源：Z.Z.
写作和编辑：Y.Z.、Z.Z.、D.T.
可视化：Y.Z.
监督：Z.Z.
资金获取：D.T.、Y.Y.、J.Z.

**利益冲突声明**
作者声明没有利益冲突。

**STAR★ 方法**
**关键资源表**
**试剂或资源**
**来源**
**标识符**为了提高分析速度，进行了降采样处理。为了量化每个细胞簇对不同组织的偏好，我们计算了每个簇在不同组织中的观察值与预期值之比（Ro/e）。每个簇-组织组合的预期细胞计数是通过卡方检验得出的。如果Ro/e > 1，则认为该簇在特定组织中富集。对于大多数簇，使用Ro/e指数定义组织偏好如下：+++，Ro/e > 3；++，1 < Ro/e ≤ 3；+，0.2 ≤ Ro/e ≤ 1。此外，为了研究T细胞簇与包括淋巴结（LN）和肿瘤在内的不同部位之间的关联，我们应用了miloR（v.1.5.0），这是一个利用K最近邻居（KNN）图和广义线性模型的差异丰度检测框架。

TCR分析使用CellRanger（v.8.0.1）和制造商提供的人类V(D)J参考基因组GRCh38-alts-ensembl’处理了单个T细胞的TCR序列。在两个或更多细胞中检测到相同的α/β链对则定义为克隆TCR，相应的T细胞被认为属于相同的克隆型。将TCR序列与10×基因组表达数据整合后，可以识别出33,158个细胞的α/β链对。为了表征T细胞的动态，我们使用STARTRAC（v.0.1.0）根据TCR轨迹计算了三个STARTRAC指数：STARTRAC-expa、STARTRAC-migr和STARTRAC-tran，分别用于量化克隆扩张、细胞迁移和状态转换。值得注意的是，由于ILC3和γδ T细胞（T09）的TCR特征不同，它们被排除在这些分析之外。

为了研究T细胞和成纤维细胞的发育起源，我们应用了在Python（v.3.11.9）中的Scanpy包（v.1.7.2）实现的基于分区的图抽象（PAGA）方法来推断潜在的分化轨迹。分析使用默认参数进行。还使用RNA速度分析了细胞轨迹，以推断二维UMAP嵌入上的动态变化。Seurat对象中的Loom文件被导出并通过Scanpy和scVelo导入到Python中。根据细胞周期阶段对细胞进行分组后计算RNA速度。然后推断出速度图，并将RNA速度流线叠加在UMAP嵌入上，以可视化细胞的预测发育方向。

使用Seurat的FindAllMarkers函数识别了每个簇中显著过表达的标记基因。调整后的p值<0.05（Wilcoxon秩和检验，BH校正）的基因被定义为簇特异的。使用Wilcoxon检验和BH校正评估了两个簇之间的差异表达。显著基因（调整后的p值<0.05）使用clusterProfiler（v4.13.0）进行了GO、KEGG和Hallmark通路富集分析。

我们使用cellphoneDB（v.3.0.0）推断T细胞簇、B细胞簇及指定的免疫细胞簇和间质细胞簇之间选定的配体-受体对的细胞-细胞相互作用。基于配体-受体对的表达预测了两个细胞亚群之间的潜在相互作用强度。通过排列检验计算了两个细胞亚群之间富集的配体-受体相互作用。我们提取了p值<0.01的显著配体-受体对。为了研究驱动ILC3_AREG细胞表型的潜在配体-靶标相互作用，我们应用了NicheNet，它将表达数据与信号通路和基因调控网络的先验知识结合起来。使用Seurat的FindMarkers函数（logFC阈值=0.5，min.pct=0.5）识别了ILC3_AREG细胞的差异表达基因（DEGs），以数据集中所有表达的基因为背景。然后进行配体活性预测，以基于其预测ILC3_AREG DEGs的能力来优先考虑最有可能的调控配体。为前20个配体推断活性配体-靶标链接，并计算了所有配体-靶标对的调控潜力得分；只保留平均调控潜力在前50%的靶标基因。分析使用NicheNet包中的nichenet_seuratobj_aggregate函数进行，其中ILC3_AREG作为发送者，M03_TAM_C1QA作为在“MLN”条件下的接收者。使用nichenet$ligand_receptor_heatmap和nichenet$ligand_activity_target_heatmap生成了配体-受体相互作用和配体在靶标上的活性的热图。

TCGA STAD数据和微阵列数据集GSE5081被用来评估从Top 10 ILC3特征中得出的基因集与临床参数（包括病理阶段、肿瘤分级和幽门螺杆菌感染状态）的关联。使用ssGSEA分数量化了胃癌患者中的基因集富集情况。

北京友谊医院病理学部门提供了人类和小鼠组织的多色免疫组化样本。样本在切除后30分钟内收集，用福尔马林固定48小时，然后使用标准程序进行石蜡包埋。石蜡块切成5μm的切片并安装在玻璃载玻片上。切片在60°C下烘烤1小时，然后通过二甲苯脱蜡，并通过分级乙醇系列（100%，90%，70%）进行复水。在EDTA缓冲液（pH 9.0）中于95°C下进行抗原恢复15分钟，然后用3% H2O2阻断内源性过氧化物酶活性10分钟。用10%的正常驴血清阻断非特异性结合10分钟，然后在37°C的湿润室中与一级抗体孵育1小时。

使用四色多重IHC试剂盒（Absin，abs50012）进行了多重免疫荧光染色。该试剂盒采用了酪胺信号放大（TSA）技术。为了验证肿瘤标本中的CD4+CCL20+ T细胞，一级抗体为抗-CD4（1:100，ZM-0418，ZSGB-BIO）、抗-CCL20（1:100，MAB360-100，R&D）和抗-FOXP3（1:100，98377S，Cell Signaling Technology）。为了验证人类淋巴结中的转移性肿瘤特征，抗体为抗-Keratin 17/19（1:500，12434S，Cell Signaling Technology）和抗-CD24（1:100，ab199140，Abcam）。为了验证微转移特征，抗体为抗-CD3（1:100，AB5690，Abcam）和抗-RORγt（1:100，NBP3-20481，Novus Biologicals）。在PBS中洗涤三次（每次3分钟）后，使用KEYENCE BZ-X800显微镜和KEYENCE viewer软件根据制造商的协议可视化抗原-抗体复合物。

对于小鼠组织的验证，从C57BL/6小鼠在治疗后的0天、7天和15天收集腹股沟淋巴结，以评估ILC动态，以及从Rag1?/?小鼠收集淋巴结以验证肿瘤转移。小鼠淋巴结的处理方法与人类组织相同，包括石蜡包埋、切片、抗原回收、抗体染色和可视化。抗体为抗-CD3（1:100，AB5690，Abcam）、抗-RORγt（1:300，AB207082，Abcam）和抗-Keratin 17/19（1:500，12434S，Cell Signaling Technology）。

使用8 μm孔径的Transwell室（Corning，USA）在24孔板上进行了Transwell迁移试验。将10^6个MFC细胞接种到上层室中，而下层室则添加了经过不同处理的ILC3细胞。ILC3细胞分别用IL-1β（1:500）、IL-23（1:500）单独处理，或IL-1β/IL-23与重组PDGFC蛋白（100ng/μl，HY-P73354，MCE）联合处理，或IL-1β/IL-23与PDGFC和AREG中和抗体AR37（1μg/ml）联合处理。共培养24小时后，移除留在膜上表面的细胞，并用4%福尔马林固定下层表面上迁移的细胞，并用0.1%结晶紫溶液染色。通过显微镜检查量化迁移的MFC细胞数量。所有实验进行了三次独立的生物学重复，每种条件分析三次。

总RNA使用RNeasy试剂（Qiagen，德国）根据制造商的说明提取。使用SYBR Premix Ex Taq Master Mix（Takara，日本）进行了逆转录定量PCR（RT-qPCR）。使用GAPDH作为内源性对照。相对基因表达水平使用2^(-ΔΔCt)方法计算，并归一化到GAPDH表达。所有实验进行了三次独立的生物学重复，每个样本在技术上进行了三次重复分析。RT-qPCR使用的引物序列如下：Areg正向引物，5′-GGTCTTAGGCTCAGGCCATTA-3′和反向引物，5′-AGAGTTCACTGCCAGAAGGC-3′；Gapdh正向引物，5′-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3′和反向引物，5′-AGACAACCTGGTCCTCAGTGT-3′。

从小鼠Rag1?/?中收获小肠，并将其置于冰冷的HBSS中。去除肠系膜脂肪和Peyer斑块后，将肠道组织纵向打开，用PBS彻底冲洗，然后切成小块。组织在含有2% FBS、5 mM EDTA和5 mM HEPES的预温溶液I中（ Colon为50 mL，小肠为100 mL）在37°C下振荡处理以去除上皮成分。剩余的组织收集后，在含有2% FBS、胶原酶II（0.5 mg/mL）、胶原酶III（0.5 mg/mL）和DNase I（0.5 mg/mL）的预温溶液II中（Colon为25 mL，小肠为50 mL）在37°C下进一步消化，以释放固有层免疫细胞。消化后，细胞悬浮液通过70-μm细胞过滤器过滤，并在500 × g下离心5分钟。然后将分离出的肠道免疫细胞用生物素标记的抗体混合物进行谱系耗竭处理，包括TER-119/红系细胞、CD45R/B220、KLRG1、CD11b、Ly-6G/Ly-6C（Gr-1）、CD3ε和NK-1.1（BioLegend），在4°C下暗处孵育15分钟。根据制造商的说明，使用MojoSort Streptavidin Nanobeads（BioLegend，480015）进行谱系阳性细胞的磁分离耗竭。随后，将谱系阴性的部分用生物素标记的抗-mouse CD127（IL-7Rα）抗体（BioLegend，135005）孵育，并使用MojoSort Streptavidin Nanobeads富集以获得CD127+ ILC3富集 populations。根据CD45+Lin?CD127+RORγt+细胞的表型，通过流式细胞术评估分离出的ILC3的纯度。

纯化的ILC3被过继转移到携带肿瘤的受体小鼠体内。简而言之，小鼠的足垫接种肿瘤细胞以建立淋巴结转移模型。肿瘤植入后，将纯化的ILC3注射到引流淋巴结区域。在指定时间点收集腘淋巴结，以评估ILC3的积累和肿瘤细胞定植。

统计分析使用R（v4.2.1）进行。根据实验设计选择适当的统计测试，并在相应的图例中说明。两组之间的统计差异使用双尾Student’s t检验进行分析，而多个组之间的比较则使用Kruskal–Wallis检验，随后进行Dunn的多重比较检验。对于多重比较，使用Benjamini-Hochberg（BH）程序调整p值以控制假发现率（FDR）。调整后的p值<0.05被认为是统计学上显著的。

对于以箱线图形式呈现的数据，中心定义为中位数，箱体表示四分位数范围（IQR；第25-75百分位数），须延伸到1.5 × IQR范围内的最极端数据点。小鼠体重数据以平均值±标准误差（SEM）表示。在适用的图例中标明了重复次数。

补充信息（2）
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数据S1. 表S1–S7（PDF（46.92 MB）
文档S2. 文章加上补充信息