木犀属植物丁香病毒诱导基因沉默体系的建立及花香相关基因SvTPS3的功能鉴定

《Plants》：Establishment of a Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) System in Syringa villosa and Functional Characterization of the Floral Scent-Associated Gene SvTPS3

　　

木本观赏植物的功能基因组学研究常因缺乏有效的基因功能验证工具而受到限制。病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing, VIGS）提供了一种快速的反向遗传学方法用于功能分析，尤其适用于稳定转化仍具挑战性的植物物种。然而，对于具有重要花卉性状的木本观赏物种毛丁香（Syringa villosa），尚未建立适用于组织的VIGS体系。本研究以八氢番茄红素脱氢酶基因（SvPDS）作为报告基因，建立并优化了农杆菌（Agrobacterium）介导的毛丁香VIGS体系。评估了不同接种方法和农杆菌浓度以确定基因沉默的适宜条件。采用OD600为0.8的农杆菌悬浮液进行注射器渗透法获得了最高的SvPDS沉默效率（80.00%），并显示出对后续功能研究的良好适用性。优化的VIGS体系进一步从营养组织扩展到花组织，并应用于候选萜烯合酶基因SvTPS3的功能分析。沉默SvTPS3显著降低了转录本丰度，并减少了毛丁香花中主要挥发性化合物(E)-β-罗勒烯的释放速率。本研究建立了适用于毛丁香营养组织和花组织的VIGS平台，并为木本观赏植物中与花卉性状和次生代谢相关基因的功能鉴定提供了有价值的工具。

研究背景

木本观赏植物通常世代周期长且难以进行遗传转化，这严重制约了对其重要性状的功能基因组学研究。毛丁香（Syringa villosa）是一种重要的木本观赏植物，具有鲜艳的花朵、丰富的开花量和宜人的香气等宝贵的花卉性状，但其花色、花香等性状背后的基因和代谢通路由于缺乏高效的遗传操作工具而鲜有表征。花香由复杂的挥发性有机化合物混合物决定，其中萜类化合物是最丰富和多样化的花卉挥发物组之一，而萜烯合酶（terpene synthases, TPSs）是催化其生物合成的关键酶。尽管病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing, VIGS）作为一种无需稳定转化的快速反向遗传学方法已在多种植物中成功应用，但在毛丁香中尚未建立系统化且优化的VIGS体系。因此，开发一个有效的毛丁香VIGS平台对于功能鉴定与花卉性状和次生代谢相关的基因至关重要。

研究目的与结论

为解决上述问题，研究人员旨在利用八氢番茄红素脱氢酶基因（SvPDS）作为报告基因，建立并优化农杆菌（Agrobacterium）介导的毛丁香VIGS体系，评估不同接种方法和农杆菌浓度的影响。随后将该优化体系应用于花组织，对候选萜烯合酶基因SvTPS3进行功能分析。研究得出结论：注射器渗透法结合OD₆₀₀=0.8的农杆菌浓度是实现高效基因沉默的最佳条件；沉默SvTPS3显著降低了(E)-β-罗勒烯的释放速率，表明SvTPS3参与调控毛丁香花中该主要挥发性化合物的积累。这一VIGS平台的建立为木本观赏植物花卉性状和次生代谢相关基因的功能研究提供了有效工具。

关键技术方法

1. 1.
   VIGS载体构建：基于烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus, TRV）双元载体系统（pTRV1和pTRV2），将SvPDS和SvTPS3的300 bp靶标片段分别插入pTRV2载体，构建重组质粒pTRV2-SvPDS和pTRV2-SvTPS3。
2. 2.
   农杆菌介导的VIGS体系建立与优化：将重组质粒转化至根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株。对四周龄毛丁香幼苗，比较了四种接种方法（注射器渗透法、摩擦接种法、根部灌洗法和真空渗透法）和四种农杆菌浓度（OD₆₀₀=0.5, 0.8, 1.0, 1.5）对SvPDS沉默效率的影响，以光漂白表型作为评价指标。
3. 3.
   花组织VIGS应用：将优化后的条件（OD₆₀₀=0.8，真空渗透法）应用于盛花期毛丁香的离体花瓣，对SvTPS3进行沉默处理，24小时后取样分析。
4. 4.
   表型与分子验证：通过观察SvPDS沉默后的光漂白表型评估沉默效率；利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）检测SvPDS和SvTPS3的转录本水平；测定叶绿素和类胡萝卜素含量进行生理验证。
5. 5.
   挥发性化合物分析：采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（Headspace Solid-Phase Microextraction-Gas Chromatography-Mass Spectrometry, HS-SPME-GC-MS）分析毛丁香花瓣中的挥发性化合物成分及含量变化。
6. 6.
   序列与系统发育分析：通过同源克隆和RACE技术获得SvTPS3全长cDNA，并进行保守结构域分析、多序列比对和邻接法系统发育树构建。

研究结果

2.1. 毛丁香中SvPDS和SvTPS3的VIGS载体验证**

通过限制性酶切、菌落PCR和测序分析，成功确认了重组pTRV2-SvPDS和pTRV2-SvTPS3载体的正确构建。

2.2. 用于SvPDS沉默的农杆菌浓度优化**

农杆菌悬浮液的浓度显著影响沉默效率。在注射器渗透法下，OD₆₀₀=0.8时沉默效率最高（80.00%），而OD₆₀₀=0.5、1.0和1.5的效率分别为63.64%、35.71%和42.86%。真空渗透法也呈现相似趋势，OD₆₀₀=0.8时效率最高（72.73%）。根部灌洗法效率相对稳定但有限，摩擦接种法则随浓度升高呈下降趋势。因此，选择OD₆₀₀=0.8作为后续实验的适宜细菌浓度。

2.3. SvPDS沉默的接种方法优化

在四种接种方法中，注射器渗透法和真空渗透法表现出较高的SvPDS沉默效率，分别为80.00%和72.73%，而根部灌洗法和摩擦接种法的最大效率低于50%。考虑到操作的简便性和适用性，注射器渗透法结合OD₆₀₀=0.8被选为最优策略。

2.4. 毛丁香中SvPDS沉默的表型和分子验证**

与空载体对照相比，接种pTRV2-SvPDS的植株在15天开始出现散落的白色斑点，并在30天和45天时出现更明显的光漂白症状。qRT-PCR分析证实，在所有检测时间点，pTRV2-SvPDS处理植株的内源SvPDS转录本水平均显著降低，其中在15天时抑制最强。光合色素含量的测定结果也与光漂白表型一致，进一步支持了优化VIGS条件的有效性。

2.5. 候选萜烯合酶基因SvTPS3的分子鉴定与功能分析**

2.5.1. SvTPS3的克隆与生物信息学鉴定

通过同源克隆和RACE技术从盛花期的毛丁香花朵中获得SvTPS3的全长cDNA序列（1856 bp），包含一个1776 bp的完整开放阅读框，编码591个氨基酸。保守结构域分析显示其具有植物TPS家族的典型特征。系统发育分析将SvTPS3与来自桂花（Osmanthus fragrans）和油橄榄（Olea europaea）的单萜合酶蛋白聚为一支。

2.5.2. 利用优化VIGS体系对SvTPS3进行功能分析**

与空载体对照相比，经pTRV2-SvTPS3处理的毛丁香花瓣中，SvTPS3转录本水平显著降低。同时，(E)-β-罗勒烯的释放速率也显著减少，约为对照水平的50%。而其他主要挥发性化合物如α-法呢烯、α-姜黄烯、trans-β-罗勒烯和苯乙酮的释放速率无显著差异。这表明SvTPS3特异性地参与了毛丁香花中(E)-β-罗勒烯的积累调控。

讨论与结论

讨论部分总结：

研究人员指出，木本植物难以遗传转化限制了其功能基因组学研究，而本研究首次为毛丁香建立了优化的VIGS体系。他们讨论了影响VIGS效率的多重因素，包括接种方法和农杆菌浓度，并指出注射器渗透法与OD₆₀₀=0.8的组合在本研究中表现最佳，这可能与木本植物对农杆菌介导VIGS反应的宿主特异性有关。通过与绣球花、牡丹、连翘等其他观赏植物中成功的VIGS应用相比较，研究人员认为本研究结果支持VIGS作为观赏植物功能基因组学工具的广泛适用性。研究人员还讨论了光漂白表型与SvPDS转录本丰度变化在时间上不完全平行的现象，认为这可能反映了转录沉默到表型显现之间存在时间滞后，以及光漂白可能涉及次级生理效应。关于SvTPS3的功能，研究人员认为其沉默导致(E)-β-罗勒烯特异性减少，暗示该基因优先参与此单萜的合成，但仍需生化实验（如异源表达和酶活分析）来最终确认其催化功能和底物特异性。最后，研究人员指出了本研究的局限性，包括VIGS效率可能因组织、发育阶段和目标基因而异，并建议未来应结合稳定转化、生化表征和多组学方法来阐明花香形成的调控机制。

结论部分翻译：

本研究利用SvPDS作为报告基因，为毛丁香建立并优化了一个农杆菌介导的VIGS体系。通过比较不同的接种方法和农杆菌浓度，确定了注射器渗透法配合OD₆₀₀为0.8的农杆菌悬浮液是实现高效基因沉默的适宜条件。该优化的VIGS体系不仅在营养组织中成功应用，还成功扩展到了毛丁香的花组织。此外，利用该平台评估了候选萜烯合酶基因SvTPS3的功能，沉默SvTPS3导致了转录本丰度的降低以及花中(E)-β-罗勒烯积累量的减少。本研究建立的毛丁香VIGS体系为丁香属植物的功能基因组学研究提供了一个有效工具，并促进了对该属植物花卉性状和次生代谢相关基因的研究。