高脂饮食衍生代谢物尿苷二磷酸（UDP）经P2Y6受体信号损害肠上皮再生

《Gut Microbes》：High-fat diet-derived metabolite uridine diphosphate (UDP) impairs epithelial regeneration by P2Y6-receptor signaling

　　

肥胖（Obesity）与影响代谢变化和器官功能的慢性低度炎症（chronic low-grade inflammation）相关。肠上皮屏障（intestinal epithelial barrier, IEB）受损和肠道微生物群改变被认为通过在很大程度上未明确的机制促进该表型。在此，研究人员使用大鼠饮食诱导肥胖模型研究高脂饮食（high-fat diet, HFD）、肠道微生物群组成、代谢性粪便内容物与IEB再生之间的早期相互作用。雄性Wistar大鼠随意接受HFD或低脂饮食（low-fat diet, LFD）。HFD喂养导致体重增加和口服葡萄糖耐量受损。IEB功能受损表现为HFD大鼠血液中脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）水平升高和结肠样本中连接蛋白Claudin-3、4和Desmoglein-2表达降低。结肠微生物群的16S-rRNA标记基因测序显示HFD大鼠系统发育多样性降低和微生物群落组成显著改变。详细分析显示，HFD大鼠内容物在类器官（organoid）测定中损害肠上皮再生。代谢组学分析鉴定出尿苷单磷酸/尿苷二磷酸（uridine monophosphate/uridine diphosphate, UMP/UDP）代谢物在HFD样本中强烈富集。UDP成为通过P2Y₆受体信号介导上皮再生受损的关键代谢物，因为用拮抗剂MRS2578对P2Y₆进行药理抑制减弱了UDP和HFD诱导的上皮再生丧失。总之，这些数据表明，饮食依赖性粪便代谢物UDP在早期肥胖中通过P2Y₆受体信号损害肠上皮修复。这些发现将上皮再生受损与肥胖相关低度炎症的发生联系起来。

研究背景与问题：肥胖已被世界卫生组织认定为流行病，与2型糖尿病、心血管疾病和某些癌症等严重健康问题相关，并造成巨大社会经济负担。肥胖诱导的代谢病和器官并发症由脂肪组织慢性低度炎症引起，越来越多证据表明肠道在肥胖相关代谢功能障碍中发挥中心作用。肥胖的一个标志是“leaky gut”，即肠上皮屏障（intestinal epithelial barrier, IEB）功能受损。细菌脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）从肠腔转位入循环是肠屏障功能障碍的关键标志，也提示肥胖患者和动物模型存在再生受损；系统性细菌LPS促进慢性低度炎症并与肥胖相关并发症相关。IEB由肠上皮细胞、杯状细胞和Paneth细胞等特化细胞单层构成，旁细胞间隙由紧密连接、黏附连接和桥粒等连接蛋白复合体封闭，形成选择性屏障以调节营养吸收并防御有害物质。上皮更新、分化和再生对恢复上皮稳态必不可少。肠道微生物群通过尚不明确的机制调节肠上皮完整性，而高热量饮食和肥胖与肠道微生物群落改变相关，提示微生物群是肥胖相关上皮功能障碍的关键介质。旨在稳定IEB和整体上皮再生的疗法，如小分子药物和微生物群移植，在降低内毒素血症和改善代谢健康方面显示希望，但肠道微生物群、微生物代谢物与肠上皮之间的精确相互作用和机制细节仍有限。因此，研究人员在饮食诱导肥胖（diet-induced obesity, DIO）大鼠模型中研究HFD诱导肥胖如何影响肠屏障完整性、上皮再生、微生物组成和肠道代谢物，并因结肠微生物密度和代谢活性高而聚焦结肠。该研究假设结肠腔微生物衍生代谢物通过改变上皮细胞完整性和促进炎症导致肠上皮功能障碍及再生受损。该研究发表在《Gut Microbes》。

关键技术方法：研究人员使用雄性远交Wistar大鼠（Wistar Crl:WI，n=12；来自Charles River, Sulzfeld, Germany；5–7周龄，250–300 g），分为低脂饮食（low-fat diet, LFD；n=6）和高脂饮食（high-fat diet, HFD；n=6；60%能量来自脂肪）喂养8周，建立DIO模型并收集结肠内容物。体外采用Caco-2细胞和由3只个体小鼠生成的小鼠肠道类器官，进行二维单层划痕愈合、跨上皮电阻（transepithelial electrical resistance, TEER）、Ki67染色和三维活细胞成像分析；采用16S-rRNA标记基因测序分析结肠微生物群；采用RNA测序、KEGG和基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）；采用非靶向和靶向LC-MS代谢组学；采用Western blot、免疫荧光和RT-qPCR；并使用P2Y₆拮抗剂MRS2578和ERK抑制剂FR180204进行药理学干预。

研究结果：
高脂饮食大鼠出现肥胖表型、葡萄糖耐量受损和肠屏障功能丧失：HFD大鼠体重显著高于LFD大鼠（575±8 g vs. 513±10 g，p<0.001），门静脉血清LPS升高且与体重相关，空腹血糖和口服葡萄糖耐量试验（OGTT）曲线下面积升高。16S-rRNA测序显示HFD大鼠Faith系统发育多样性降低、Bray–Curtis β多样性改变，Firmicutes/Bacteroidota比例趋于升高，Prevotella降低，Pseudobutyricicoccus增加，差异相关网络改变。结论是该模型匹配肥胖和代谢综合征临床特征，伴肠屏障受损和微生物群改变。

肥胖大鼠显示局部肠道炎症并伴结肠连接蛋白变化：系统性和门静脉血细胞因子无差异，但结肠TNFα增加，Tlr2和Tlr4 mRNA表达增加；结肠转录组GSEA显示MAPK、PI3K-Akt、细胞周期和细胞骨架通路富集。Western blot显示Desmoglein-2（DSG2）、Claudin-3（CLDN3）和Claudin-4（CLDN4）降低，E-Cadherin（CDH1）无显著变化；免疫荧光确认CLDN3降低。结论是HFD诱导结肠局部促炎信号和连接蛋白重塑。

HFD大鼠结肠内容物导致肠上皮再生受损：Caco-2细胞中HFD内容物降低TEER；非汇合二维类器官中HFD内容物使TEER未能升高；划痕实验中HFD内容物最强地损害再生。类器官中Tlr2/Tlr4 mRNA不变，CLDN3降低，TNFα增加，p-IkBa/IkBa无变化，MAPK通路富集。结论是HFD肠腔内容物可重现体内屏障缺陷并损害上皮成熟、生长和再生。

HFD和LFD大鼠结肠内容物代谢组学显著不同，HFD结肠内容物中UMP/UDP相关代谢物增加：非靶向代谢组学将两组分开，40%注释特征显著差异；靶向代谢组学确认分离，尿苷单磷酸（UMP）、尿苷二磷酸（UDP）、UDP-N-乙酰葡糖胺（UDP-GlcNAc）和UDP-葡萄糖（UDP-Glc）在HFD组数值增加，但HFD变异大、未达统计显著。结论是HFD改变结肠代谢组，尿苷相关代谢物呈增加趋势。

HFD诱导的上皮再生受损由UDP诱导的P2Y₆受体激活介导：UDP-Glc单独不影响伤口愈合、TEER和MAPK信号；UDP显著损害伤口愈合，MRS2578减弱UDP和HFD诱导的再生丧失。HFD内容物降低Ki67阳性细胞比例，MRS2578恢复；ERK抑制剂FR180204在HFD条件下改善伤口愈合。三维活细胞成像显示HFD内容物使类器官生长率数值降低、倍增时间延长，MRS2578可逆转趋势，但未达统计显著。结论是UDP通过P2Y₆受体信号介导HFD诱导的上皮再生受损。

讨论部分总结：讨论指出，研究旨在获得微生物组成和肠道代谢组改变如何导致肥胖中IEB功能和上皮再生受损的机制见解。HFD大鼠连接蛋白降低和LPS升高提示屏障功能受损和组成重塑，但未观察到系统性炎症标志物，而TNFα和Tlr2/Tlr4上调提示结肠上皮局部促炎信号；8周短期模型提示局部炎症可能先于可测量的系统性细胞因子升高，但当前数据未提供上皮修复受损与炎症因果相关的直接体内证据。微生物群分析显示HFD不仅改变组成，也改变微生物相互作用，涉及Akkermansia、Bifidobacterium、Alistipes和Limosilactobacillus等。体外将HFD肠内容物应用于Caco-2和小鼠类器官，首次显示其诱导与肥胖大鼠结肠相同表型，包括CLDN3丢失和上皮TNFα增加，体内结肠转录组与体外上皮反应匹配。代谢组学非靶向分析确认深度代谢变化但未能鉴定目标化合物；靶向分析突出尿苷代谢物，尤其是UDP-Glc和UDP。UDP被鉴定为潜在介导上皮再生受损的代谢物，P2Y₆抑制消除UDP负面效应，ERK抑制部分减弱HFD效应，GSEA支持ERK/MAPK参与。讨论也指出人类直接数据有限，但P2嘌呤能受体遍布胃肠道，P2Y₆阻断可减弱毒素诱导屏障功能障碍，NTPDase8缺陷小鼠中P2Y₆激活加重实验性结肠炎，提示P2Y₆靶向策略可能相关。

研究结论翻译：总之，当前数据表明，HFD相关的肠道微生物群和代谢物组成改变直接导致肠屏障功能受损，局部黏膜炎症先于系统性炎症变化；HFD喂养大鼠的肠内容物在体内重现屏障缺陷，并在体外上皮模型中重现再生受损；当前发现确定UDP–P2Y₆受体信号是HFD、局部炎症和早期肥胖中上皮修复缺陷之间的机制联系；这些见解为未来旨在将发现转化至临床环境的队列研究奠定基础。