84K杨水通道蛋白（AQP）基因家族亚基因组水平全基因组鉴定、进化特征与表达分析及PagPIP2;6A功能初探

《Plants》：Genome-Wide Identification and Expression Analysis of Aquaporin Gene Family in 84K Poplar

　　

水通道蛋白（aquaporins, AQPs）介导水和多种小分子的跨膜运输，在植物生长发育和胁迫响应中发挥重要作用。然而，其在杂交84K杨（Populus alba × Populus tremula var. glandulosa）中的全基因组组织及亚基因组水平演化仍未被完全表征。基于84K杨的端粒到端粒（telomere-to-telomere, T2T）基因组，研究人员鉴定了94个PagAQP，A和G亚基因组分别包含46和48个成员。系统发育分析将其分为5个亚家族，不均匀分布于29条染色体上，其中PagPIP和PagTIP为两个最大亚家族。大多数PagAQP以相应的A/G等位基因对保留，少数表现出亚基因组特异性保留。38个等位基因对和59个旁系同源基因对的有效Ka/Ks比值均低于1，表明以纯化选择为主。基因结构、保守基序和底物识别残基在亚家族内保守、在亚家族间分化。启动子含有与光、植物激素和非生物胁迫响应相关的预测顺式作用元件。表达谱显示，部分PagPIP和PagTIP成员在维管组织中高表达，并在氮和干旱处理下转录本丰度发生变化。与野生型植株相比，35S:PagPIP2;6A过表达株系在处理前较矮，停水后叶片相对含水量较高、丙二醛含量较低。本研究系统表征了84K杨PagAQP家族的亚基因组分布、进化特征和表达模式，并鉴定出可用于进一步功能研究的候选基因。

植物水通道蛋白（aquaporins, AQPs）是主要内在蛋白（major intrinsic proteins, MIPs）超家族的核心成员，可高效、选择性介导水分子及甘油、尿素、氨、CO₂和H₂O₂等小中性溶质的跨膜运输，参与根系吸水、长距离维管水运输、气孔运动、光合作用、细胞伸长以及干旱、低温和养分缺乏等非生物胁迫响应。已有研究在拟南芥、水稻、大豆、茶树和毛果杨等物种中系统鉴定了AQP家族，通常分为质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic protein, PIP）、液泡膜内在蛋白（tonoplast intrinsic protein, TIP）、NOD26样内在蛋白（NOD26-like intrinsic protein, NIP）、小碱性内在蛋白（small basic intrinsic protein, SIP）和X内在蛋白（X intrinsic proteins, XIP）等亚家族。杨树是木本植物功能基因组研究的模式树种，毛果杨中已鉴定55个AQP，但杂交84K杨具有来自双亲的A、G两个亚基因组，其AQP家族在全基因组组成、A/G亚基因组分布、亲本拷贝保留、进化保守性、启动子变异以及组织和胁迫表达方面仍缺乏系统研究。因此，研究人员基于84K杨T2T基因组和公开转录组数据，系统开展了PagAQP家族鉴定与功能初探。

研究人员共鉴定94个PagAQP，A/G亚基因组分别为46/48个，分为PIP、TIP、NIP、SIP和XIP五个亚家族；分析其系统发育、理化性质、染色体和亚基因组分布、共线性、基因结构、保守基序、底物识别残基和启动子顺式作用元件，并利用组织表达谱及干旱、氮、盐胁迫转录组解析表达模式，结合qRT-PCR验证，进一步构建35S:PagPIP2;6A过表达株系进行初步功能评价。结果表明，PagAQP家族在A/G亚基因组间总体平衡，多数等位基因对在对应位置保留并受纯化选择；PagPIP和PagTIP在维管组织中高表达，并对氮和干旱处理发生转录响应；35S:PagPIP2;6A过表达株系较野生型矮，但停水后叶片相对含水量（relative water content, RWC）较高、丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量较低。该研究为理解杂交杨AQP亚基因组进化和表达分化提供了框架，并鉴定出候选基因。

关键技术方法不超过250字：基于84K杨T2T基因组蛋白库，采用BLASTp和HMMER（PF00230）鉴定AQP，并用InterPro、SMART和CDD验证；用ProtParam、WoLF PSORT和TMHMM-2.0分析蛋白理化性质、亚细胞定位和跨膜域；用MEGA 12.0.14以邻接法（Neighbor-Joining, NJ）构建系统发育树；用TBtools-II/MCScanX进行染色体定位、种内和种间共线性及Ka/Ks分析；用MEME和Batch-CD-Search分析保守基序和结构域；用PlantCARE预测启动子顺式作用元件。转录组分析采用六套公开RNA-seq表达矩阵：叶、韧皮部、木质部（PRJNA526157），基部、中部、顶部茎（PRJNA775903），氮胁迫叶（PRJNA629424），干旱根、茎、叶（PRJCA003153），盐胁迫叶和根（PRJNA803823、PRJNA796558）；qRT-PCR验证表达，并通过农杆菌介导转化获得35S:PagPIP2;6A过表达84K杨，停水15天后测定株高、茎径、RWC和MDA。

结果部分：
2.1 全基因组鉴定与系统发育分析：通过BLASTp和HMM搜索，研究人员在84K杨中鉴定94个PagAQP，A/G亚基因组分别为46和48个，系统发育分析将其分为TIP、PIP、NIP、SIP和XIP五个亚家族；PagPIP和PagTIP为最大亚家族，各占31.91%，A/G中PIP为15/15、TIP为15/15、NIP为9/10、XIP为5/5、SIP为2/3。与毛果杨单倍型基因组相比，除PIP外，其余四个亚家族在84K杨每个亚基因组中成员均较少。蛋白理化分析显示，PagAQP长度为210–562个氨基酸，分子量（molecular weight, MW）为22,007–61,199.11 Da，理论等电点（isoelectric point, pI）为4.67–9.67，多数TIP成员pI小于7，除少数成员外不稳定指数小于40，脂族指数为77.78–129.29，GRAVY为0.024–1.06，主要定位质膜和液泡，多数含超过5个跨膜域。

2.2 染色体分布：94个PagAQP不均匀分布于A亚基因组14条和G亚基因组15条染色体上；chr09A/G、chr01A/G和chr06A/G分布较多，某些染色体未检测到PagAQP。多数PagAQP在A/G同源染色体上位置和基因顺序高度一致，呈等位基因对分布，仅少数表现亚基因组特异性保留。

2.3 共线性与复制分析：种内共线性分析鉴定164个共线基因对，84K杨与毛果杨之间鉴定208个，与拟南芥之间仅56个。Ka/Ks分析获得38个有效A/G等位基因对，所有Ka/Ks均小于1且多分布于0–0.3；A和G亚基因组内分别有32和27个有效旁系同源基因对，Ka/Ks也均小于1，表明等位和旁系同源对主要受纯化选择。

2.4 基因结构、保守结构域与基序：PagAQP可分为五个经典亚家族，同一亚家族内基序数量、类型和排列高度保守，不同亚家族间差异明显；保守结构域和外显子–内含子模式也与系统发育关系一致。多数PagPIP含4个外显子，PagNIP多含5个，PagTIP和PagXIP一般含2–4个，PagSIP含1–2个。

2.5 蛋白结构与底物识别残基：NPA基序、芳香族/精氨酸（aromatic/arginine, Ar/R）选择性过滤器和Froger位点存在亚家族特异性。PagPIP和PagTIP的NPA基序高度保守，PagNIP、PagSIP和PagXIP的NPA₁存在NPS、NPL、NPI、NPV和NPT等变异；PagPIP主要为F-H-T-R，PagTIP主要为H-I-A-V、H-I-G-R、H-I-A-R和N-V-G/S-C/S等，PagXIP为V/I/A-V-A-R，PagSIP为A/V-V-P-N，PagNIP残基组成更多样。Froger位点P₁–P₅在PagPIP、PagTIP、PagSIP和PagXIP中较保守，在PagNIP中变异较高。

2.6 启动子顺式作用元件：在翻译起始位点上游2000 bp中检测到19类主要顺式作用元件，分为光响应、植物激素响应、非生物胁迫响应、生物胁迫响应、生长发育、转录调控、昼夜节律和其他类别。光响应元件在所有PagAQP启动子中丰富，PagPIP和PagTIP启动子含最多预测元件，包括G-box、GT1-motif、ABRE、MBS、AuxRR-core、TGA-box和ARE等。A/G等位对间存在元件组成或丰度差异，如PagPIP2;4A/G和PagTIP1;3A/G。

2.7 组织特异性表达：转录组热图显示，PagPIP优先在维管组织表达，PagPIP1;1、PagPIP1;2、PagPIP1;3、PagPIP2;2和PagPIP2;3在木质部和韧皮部高表达，PagPIP2;5、PagPIP2;6和PagPIP2;7主要在木质部高表达、韧皮部较低、叶中弱表达；部分PagTIP在叶、韧皮部和木质部高表达。PagNIP、PagSIP和PagXIP整体转录丰度低。老茎中PagAQP丰度高于嫩茎。多数A/G等位对表达模式相似，个别等位对存在差异。

2.8 非生物胁迫响应：氮处理4天后，PagPIP2;3A/G和PagPIP2;6A/G表达升高，PagTIP1;5A/G和PagTIP2;2A/G降低，PagXIP2;1A/G先升后降。干旱10天后，多数PagPIP和PagTIP在根和茎中下调，而PagPIP1;2A/G、PagPIP2;3A/G、PagPIP2;5A/G和PagTIP1;4A/G在叶中上调。盐处理下叶片和根中PagAQP整体转录丰度变化不大。氮和干旱下多数等位对表达相似，部分存在差异。

2.9 qRT-PCR分析：对12个PagAQP在停水10天前后进行qRT-PCR，PagPIP2;6A、PagPIP2;5G和PagTIP1;4A/G上调，其余基因不同程度下调，趋势与转录组结果基本一致。

2.10 PagPIP2;6A过表达株系表型与生理响应：选择表达最高的OE6和OE7株系，2月龄野生型和过表达植株停水15天。处理前OE株系显著矮于野生型；处理后野生型叶片黄化和萎蔫明显，OE株系损伤较轻。相对于处理前，OE6和OE7株高分别增加10.58%和9.53%，高于野生型；野生型茎径无显著变化，OE6和OE7茎径分别显著增加12.98%和14.19%。停水后OE株系叶片RWC显著高于野生型，MDA含量显著低于野生型。结果表明，组成型过表达PagPIP2;6A与营养生长降低及干旱处理下生理响应改变相关，但仅为初步证据。

讨论部分总结：研究人员在84K杨中鉴定94个PagAQP，分属五个经典亚家族，分类与毛果杨等木本植物一致；总家族大于毛果杨的55个，但A/G亚基因组分别仅46和48个，说明总成员较多主要源于杂交组合双亲基因组成，而非杂交后谱系特异性扩张。PIP和TIP为最大亚家族且在A/G间平衡，NIP、XIP和SIP存在收缩和轻微亚基因组不对称，提示功能约束、选择性保留和基因丢失共同塑造该家族。染色体分布不均，多数等位对保留于对应位置。Ka/Ks小于1说明编码区受纯化选择，但启动子顺式元件差异可能导致时空表达和胁迫响应分化。PagPIP和PagTIP在维管组织中高表达，并在氮和干旱下变化，qRT-PCR结果与转录组一致。PagPIP2;6A过表达株系较矮，但停水后RWC较高、MDA较低，提示其可能减轻叶片失水和膜脂过氧化损伤；然而未测定细胞长度、气孔导度、蒸腾速率、叶水势及根茎水力导度，且初始株型和土壤水分未匹配，因此不能确证生长与耐旱间权衡，需严格控水、更多独立株系和功能缺失材料验证。

研究结论翻译：本研究在84K杨基因组中鉴定94个PagAQP基因，A和G亚基因组分别含46和48个成员，分为五个亚家族。其染色体分布、共线性、基因结构、保守基序、底物识别残基、启动子元件和表达谱揭示了家族内保守性与分化。多数A/G等位对保留在对应基因组位置，所分析等位对和旁系同源对主要受纯化选择。若干PagPIP和PagTIP成员在维管组织中高表达，并在氮和干旱处理下发生转录本丰度变化。35S:PagPIP2;6A过表达株系较野生型矮，但在干旱胁迫下叶片相对含水量较高、丙二醛含量较低。由于缺乏其他干旱相关生理测定，这些结果仅为PagPIP2;6A可能参与水分亏缺响应的初步证据。总体而言，本研究为理解杂交杨PagAQP进化和表达提供了亚基因组水平框架，并鉴定出可用于进一步功能验证的候选基因。