CRISPR-Cas9编辑葡萄Clade V MLO基因：MLO17主导贡献、MLO3/MLO13协同及MLO4嵌合阈值调控白粉病（Erysiphe necator）抗性与发育平衡

《Plants》：CRISPR-Cas9 Editing of Grapevine Clade V-Related MLO Genes: Grapevine Powdery Mildew Resistance (Erysiphe necator) and Plant Development Effects

　　

Clade V-MLOs（mildew Locus O，MLO）与多种植物中的白粉病（powdery mildew，PM）易感性相关。在葡萄中，四个MLO基因（MLO3、MLO4、MLO13和MLO17）属于clade V，并已被研究以确定它们对Erysiphe necator（葡萄白粉病，Grape Powdery Mildew，GPM）易感性的贡献。利用体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis）在葡萄中产生敲除突变体（knockout mutants），研究人员进行了一系列多重基因编辑（multiplex gene editing）介导的转化，以确定每个clade V相关MLO对GPM抗性的贡献。研究人员表征了四个MLO对GPM贡献的层级，其中MLO17发挥最大作用，其次是MLO3和MLO13。此外，MLO4是GPM抗性的较次要修饰因子（modifier）：其功能丧失（loss-of-function）与其他MLO组合时，赋予GPM抗性适度但一致的改善，并且具有部分野生型（wild-type，WT）MLO4等位基因嵌合（chimerism）的mlo突变体缺乏mlo相关的发育多效性效应（pleiotropic effects）。大多数mlo4突变系中的花发育缺陷表明该基因在生殖组织中发挥作用。研究人员的数据还表明clade V-MLOs内存在功能冗余（functional redundancy），尤其是MLO13与MLO17之间。最终，研究人员的结果表明，一定程度的嵌合（突变体中的野生型背景）对于获得对GPM的抗性且无重大生长缺陷或产量损失是必要的。最终，该方法为培育白粉病抗性葡萄藤同时保持农艺适应性（agronomic fitness）提供可行策略。

研究背景与问题：MLO（mildew Locus O）家族蛋白在多种植物中存在，葡萄有17个MLO。Clade IV/V的MLO直系同源物与白粉病（powdery mildew，PM）易感性相关，负调控防御，并与SNARE（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment receptor）穿透抗性蛋白共定位，影响细胞壁增强。MLO功能丧失可阻断病原侵入而抗病，但常伴多效性效应（pleiotropic effects），如坏死叶斑、其他病害易感和产量降低，限制农业应用。部分限制MLO表达或保留残余野生型（wild-type，WT）活性可减轻缺陷，如大麦mlo11和葡萄嵌合edr1。葡萄四个clade V MLO（MLO3、MLO4、MLO13、MLO17）与Erysiphe necator（葡萄白粉病，Grape Powdery Mildew，GPM）易感性有关，但各贡献和组合效应未充分阐明。此前拟南芥需同时沉默所有clade V MLO；葡萄RNAi提示MLO3、13、17敲低降低PM严重度而MLO4无作用；基因编辑MLO3部分抗性伴生长缺陷；MLO13和MLO17双突变近完全抗性无多效性。因此研究人员开展组合突变研究，以识别易感候选并评估组合效应。

研究开展与结论意义：研究人员用体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis）产生葡萄敲除突变体，进行多重基因编辑转化，确定每个clade V MLO对GPM抗性贡献。结果表明贡献呈层级：MLO17最大，其次MLO3和MLO13；MLO4为次要修饰因子，其功能丧失与其他MLO组合可适度但一致改善抗性，部分WT MLO4等位基因嵌合可避免mlo相关发育多效性。多数mlo4突变系花发育缺陷提示MLO4在生殖组织作用。数据还显示clade V MLO功能冗余，尤其MLO13与MLO17之间。一定程度的嵌合（chimerism，突变体中保留WT背景）对获得GPM抗性且无重大生长缺陷或产量损失必要。该策略为保持农艺适应性培育白粉病抗性葡萄提供可行途径。

关键方法：以微藤（microvine）04C023V0004基因型（‘Grenache’ × L1 ‘Pinot Meunier’ GAI1突变体杂交后代，由Dr. Mark Thomas，CSIRO Laboratories，Australia提供）为材料；经体细胞胚胎发生和农杆菌介导转化递送CRISPR-Cas9（成簇规律间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白9）单转录单元载体，产生单、双、三、四重mlo突变；用DECODR去卷积和长读测序基因分型；以Erysiphe necator分离物接种离体叶，结合显微观察、ImageJ定量菌丝与产孢、qPCR（定量PCR，quantitative PCR）测定真菌生物量；用qRT-PCR（定量逆转录PCR，quantitative reverse transcription PCR）分析MLO同源物表达，并采用参数/非参数统计。

研究结果：
2.1 葡萄中Clade V mlo基因及其在白粉病侵染中的诱导表达：系统发育分析确定四个葡萄MLO为已知PM易感MLO最近同源物，采用Feechan命名MLO3、MLO4、MLO13、MLO17；MLO13与MLO17相邻，提示旁系同源且蛋白序列高度相似。实时PCR显示接种后4 hpi至7 dpi表达，早期响应各异，总体在3–7 dpi较高；2–4 hpi MLO4和MLO17增加约4–5倍，24 hpi无显著变化，3 dpi仅MLO13高表达，7 dpi MLO4和MLO17再次高表达，MLO3基本不受影响；健康叶中MLO13和17比MLO3高4倍，侵染叶中高40–50倍；既往组织表达提示MLO3和MLO4主要在花和根中，支持发育功能。

2.2 CRISPR-Cas9编辑性能、基因分型、野生型嵌合与多效性效应：设计CRISPR-Cas9构建体产生单、双、三、四敲除系，体外切割验证sgRNA（单向导RNA，single guide RNA）特异性且无脱靶；部分组合因MLO4和MLO17 sgRNA多重构建性能差未分离，筛选中偶然获得mlo3,13和mlo3,13,17。DECODR和扩增子/长读测序显示，mlo3和mlo4为双等位完全编辑，mlo13和mlo17嵌合约75%未编辑WT等位；mlo13,17对MLO17嵌合；mlo3,4和mlo3,13中MLO3双等位、对应基因为单等位；qko #1嵌合，多数WT MLO4、极低WT MLO17，四MLO马赛克；qko #2嵌合，75% WT MLO17仅25%编辑。多效性方面，多数突变体生长缓慢至严重缺陷、生长停滞、不开花，部分不能存活组织培养；mlo13,17根缺陷严重且不能温室存活，qko #2严重矮化早衰且不能移栽温室；仅mlo3、mlo3,13和qko #1无多效性，生长开花结果似WT。所有突变系可在组织培养维持，三轮生长后存活者继续温室生长，但mlo4和mlo3,4仍不开花，mlo17慢生长。

2.3 mlo突变体中的白粉病抗性：基于菌丝生长、产孢和真菌生物量评估。WT接种后24 hpi多数分生孢子萌发并产生初生菌丝，72 hpi菌丝覆盖约20–45%叶面积，其中40–90%产孢。mlo3和mlo4萌发与生长似WT，但mlo3产孢降低；mlo13和mlo17超毒力，覆盖面积大于WT，24 hpi出现次生菌丝，这些为部分编辑WT嵌合系，多数细胞含WT MLO等位。mlo3,4增加菌丝扩展但密度低且产孢显著降低；mlo3,13菌丝降低而产孢不变；mlo13,17和mlo3,13,17菌丝扩展增加；qko #2支持WT真菌生长但显著抑制产孢；qko #1的MLO3、13、17完全编辑、MLO4部分编辑，完全抑制真菌生长，24 hpi无萌发和初生菌丝，多次试验仅两例小菌落局限叶基。qPCR测14 dpi真菌生物量，单突变均无降低，mlo13和mlo17显著增加，qko #1可忽略。结论：完全PM抗性可能需四个MLO特定比例突变，MLO3、13和17作用重要；产孢抑制与MLO3和MLO4突变相关，额外MLO17突变也降低菌丝生长。

2.4 突变体中MLO直系同源物的表达模式：qRT-PCR检测单敲除和qko #1在72 hpi和2 wpi表达。无PM感染时突变体与WT无显著差异，提示早期无补偿。挑战PM时，MLO3在mlo4、mlo13、mlo17中无显著变化；MLO4在WT不响应PM，但在mlo3中显著高表达；MLO13在WT受诱导，在mlo3、mlo13、mlo17中更明显，提示MLO13可能补偿MLO3和MLO17缺失；MLO17在WT受诱导，但除mlo3外所有突变体中显著降低；qko #1无补偿且MLO13和MLO17较WT显著降低。2 wpi，MLO3无差异；MLO4在感染WT高于非感染约10倍，在mlo3中远高于WT；MLO13在mlo3和mlo13维持高表达，并在感染mlo4中高表达；MLO17在后期突变体中诱导最高，在感染mlo13中高50倍。结论：MLO4可能早期响应MLO3和MLO13缺失而高表达；MLO13最响应其他同源突变；MLO17在嵌合mlo13中因旁系同源部分缺失而增加。

讨论总结：研究人员指出VvMLOs 3、4、13、17诱导与既往趋势一致，MLO13和17在72 hpi表达远高于MLO3和4，提示主要参与PM易感性；突变影响产孢和菌丝生长。多数突变体呈复杂马赛克编辑和WT嵌合，可能源于CRISPR质粒在单细胞阶段或之后导入、Cas9延迟活性和增殖胚结构细胞随机编辑。嵌合mlo13和mlo17仅25%编辑时，残余功能MLO意外支持超毒力生长；研究人员假设mlo介导抗性为细胞自主，编辑与未编辑细胞交错迫使真菌跨越更广面积觅食，增加菌丝扩展但不相应增产孢；部分MLO功能丧失也可能增加近缘旁系表达使植株更易感。qko #1中MLO13和MLO17完全编辑限制菌丝生长；mlo3,4等组合显著降低产孢，提示MLO3和MLO4共同参与产孢。既往葡萄非嵌合单/双突变报告部分至显著抗性，而本研究中单突变无PM抗性，完全抗性仅在四MLO突变qko #1出现；qko #2仅部分抗性并严重发育缺陷。qko #1编辑复杂马赛克，MLO3和MLO17完全无功能，多数细胞带编辑非功能MLO17、仅12%细胞有功能WT等位，而80%细胞保留功能WT MLO4，却完全抗PM且无mlo相关多效性；qko #2则MLO3和MLO4完全编辑而MLO13和MLO17编辑极低，多数细胞保留功能PM易感MLO13和MLO17；比较表明mlo17等位对攻击抗性贡献最大，其次mlo3和mlo13。此与拟南芥MLO不平等冗余及小麦弱突变、大麦mlo-11、葡萄edr1嵌合减轻多效性一致。完全无效mlo突变常带高农艺成本；部分MLO活性可能功能拯救，确保存活且完全抗PM；不需要严格嵌合比例，而需要时间上残余WT活性阈值，如MLO4控制基本发育过程。复杂嵌合和功能重叠使特定多效性归因困难，环境互作也影响表型。mlo4和mlo3,4完全编辑MLO4不开花，提示MLO4在营养和生殖发育中起主要作用，远超PM易感性辅助作用；未编辑或不完全编辑MLO4株系无开花缺陷，证实天然MLO4背景活性可防严重发育惩罚并允许增强抗病。研究支持clade V MLO功能冗余，解释单/双突变无抗性及部分编辑避免多效性；补偿可跨分支，如拟南芥AtMLO2和AtMLO7。本研究提示MLO4和MLO13补偿MLO3，MLO13和MLO17长期补偿其他同源物缺失；筛选其他MLO可能揭示clade V外MLO参与。最终，维持关键天然MLO表达阈值可将完全PM抗性与严重发育惩罚解偶联。

结论部分翻译：总体而言，葡萄MLO3、MLO4、MLO13和MLO17突变对PM抗性贡献不等。实现PM抗性而无严重不利效应需要平衡突变基因型，维持一个或多个部分功能同源物的关键表达阈值，这些同源物控制其他发育过程。抗性四重突变体qko #1编辑谱显示，MLO17对PM易感性贡献大于MLO3和MLO13。最终，研究人员对这些马赛克株系的表征表明，完全PM抗性可与严重发育惩罚解偶联。虽然本研究中观察到的嵌合在组织培养中自发发生，但这些株系为平衡免疫与植物生长而不损害农艺适应性或产量提供概念验证。未来研究应在田间条件下评估嵌合株系，并评估不同环境背景下的持久性。