动物血清中GnRH激动剂Deslorelin及其含ProNHEt降解产物的Clostripain酶解-GC-MS/MS定量方法

《Toxics》：Proposed Method for Mass Spectrometric Measurement of the Gonadotropin-Releasing Hormone Agonist Deslorelin

　　

Deslorelin（C₆₄H₈₃N₁₇O₁₂）是一种肽类促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone, GnRH）激动剂药物，单同位素质量为1281.64 Da，在兽医学中作为药物释放植入剂用于促进排卵以及雄性/雌性避孕。尽管相对安全，但其被怀疑具有生殖毒性，并可能对未出生或哺乳期儿童造成危害。该化合物被设计为高效力且半衰期延长，这使其在血清中难以定量测定。一种Deslorelin液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）方法依赖于检测未代谢、未降解的完整肽，这是关键考虑因素，因为某些代谢物被认为具有活性。研究人员提出一种通过裂解Deslorelin羧基末端含有修饰脯氨酸ProNHEt（N-ethyl-2-pyrrolidine carboxamide，N-乙基-2-吡咯烷甲酰胺）的独特片段来间接分析Deslorelin的方法，该片段可被对精氨酸键特异的Clostridiopeptidase去除。ProNHEt可从消化后的血清中提取，反应生成N-t-butyldimethylsilyl衍生物，并通过气相色谱-串联质谱（gas chromatography-tandem mass spectrometry, GC-MS/MS）分析。对设置进行了优化，使可检测性达到<1 ppb，并通过调节溶剂、反应时间、温度和添加剂使衍生化产率最大化。将基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization–time-of-flight, MALDI-TOF）应用于Deslorelin，揭示了铜的结合。所提出的方法可用于测定来自各种动物园动物和小型动物的血清样品中的Deslorelin。通过检测释放的ProNHEt来检测Deslorelin，预计可适用于其他具有ProNHEt结构的GnRH超级激动剂，如triptorelin和Deslorelin降解产物。

Deslorelin（C₆₄H₈₃N₁₇O₁₂）是一种肽类促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone, GnRH）激动剂，单同位素质量1281.64 Da，在兽医领域以缓释植入剂用于促进排卵和雄/雌性避孕。其设计具有高效力和长半衰期，导致血清定量困难。虽然相对安全，但其被怀疑具有生殖毒性，可能危害未出生或哺乳期儿童，并被列为Category 1B生殖毒物。现有酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）虽灵敏度可达0.01 ng/mL，但存在假阴性或假阳性可能，且高度依赖抗体稳定性，批间抗体结构不确定；反相高效液相色谱和液体二次电离质谱方法非特异且不灵敏；超高效液相色谱-串联质谱（ultraperformance liquid chromatography–tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS）可测定完整Deslorelin，检出限为8 pg/mL，但仅限完整GnRH类似物结构，不能覆盖常具激素活性的降解产物。Herbert等发现Deslorelin植入可控制wallabies繁殖；猫避孕效果超过6至12个月并延迟生殖功能恢复；Ferre’-Dolcet等发现猫移除4.7 mg植入剂后需3–7周恢复卵巢功能；Saint Louis Zoo科学家观察到动物园动物植入后不育可持续长达十年。因此研究人员开展本研究，旨在建立可准确定量动物血清中Deslorelin及其含ProNHEt降解产物的GC-MS/MS新方法，检测限达0.6 ppb。

关键技术方法简要概括：以Clostripain（来自Clostridium histolyticum）特异性切割Arg-ProNHEt，释放ProNHEt；酶反应需Ca²⁺和DL-dithiothreitol（DTT），pH 7.2–7.8，并加入trientine螯合铜、butylated hydroxytoluene（BHT）抗氧化及优化温度；血清经乙腈沉淀/液液萃取、NaCl盐析、冷冻去脂、氮吹浓缩，加入N,N-dimethylformamide和HCl减少挥发损失；ProNHEt与N-tert-butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide（MTBSTFA）衍生为t-butyldimethylsilyl（tBuDMS）衍生物；采用GC-MS/MS多反应监测（multiple reaction monitoring, MRM）定量；并用MALDI-TOF和Hyperchem分子力学进行结构研究。样本来源：未使用临床治疗动物队列，主要基质为牛血清（bovine serum），用于加标与对照实验。

研究结果：3.1 在GC-MS/MS上建立MRM检测方法：通过全扫描电子轰击质谱和产物离子研究，ProNHEt-tBuDMS预期分子离子m/z 256，主要碎片为m/z 184、199、241；优化碰撞能量后，m/z 184→73最灵敏，被选为定量MRM，其他qualifier MRM相对面积均小于10%。3.2 高灵敏度色谱设置优化：研究比较MTBSTFA反应温度、碰撞气氮流量、检测器增益、进样口温度和初始柱温，发现60 °C优于70 °C，氮气1 mL/min、增益10–40线性、进样口210 °C、初始炉温110 °C较优；10–10,000 ppb范围内线性R²=0.9989。3.3 ProNHEt检出限和定量限：由信噪比法得到LOD=0.15±0.08 ppb，LOQ=0.60±0.3 ppb；qualifier MRM面积比在1.0–1000 ppb较一致，0.1 ppb显著升高，与LOQ相符；0.1和1.0 ppb手动信噪比分别为33.7和54.7。3.4 额外验证：八条50–10,000 ppb标准曲线平均R²=0.99605±0.00331，残差无明显趋势；日间%RSD为4.5%–8.8%，日内%RSD为0.3%–6.6%；qualifier MRM特异性结果稳定；仪器残留平均0.0055%±0.012%；标准曲线准确度为95.2%–103.5%；36次扫描平均保留时间10.894±0.198 min，%RSD=1.8%；平均回收率约35%，研究人员提出固相萃取可改善回收。3.5 内标考虑：本工作未使用内标；建议在Clostripain消化前加入triptorelin，产物为Pro-Gly酰胺，其tBuDMS衍生物分子量271.2，可与ProNHEt分子离子256.2区分，但专用内标成本较高。3.6 Clostripain裂解优化：Clostripain需Ca²⁺，且受Cu²⁺抑制；加入trientine后平均回收由30.1%±12.1%提高至42.5%±3.3%；BHT可提高ProNHEt总产率，但对紫外暴露无改善；血清加入25、50或75 μL可近线性增加ProNHEt面积计数，提示血清具有保护作用；最佳温度约32 °C。3.7 ProNHEt提取改进：为防止氮吹时胺挥发损失，加入N,N-dimethylformamide或转为HCl盐；150 μL 0.1 M HCl优于0或300 μL；在氮吹前将乙腈相于?20 °C冷冻1 h可去除脂层，使回收约加倍。3.8 概念验证：设置六组对照，分别为Clostripain+Deslorelin、Clostripain单独、Clostripain+血清、Deslorelin单独、血清单独、Clostripain+ProNHEt；仅Clostripain+Deslorelin和Clostripain+ProNHEt预期检测到ProNHEt，结果均符合预期并重复成功，说明血清、酶自解或Deslorelin自发降解未产生假阳性；Deslorelin终浓度100 μg/mL，高于动物血清有效浓度约25 ng/mL。3.9 目标Deslorelin结构研究：MALDI显示Deslorelin存在+H⁺、氧化物种及铜复合物；经校正MALDI质量误差后，消化后峰群向低质量移动，符合释放ProNHEt并形成末端COOH的裂解产物，多数预期裂解产物m/z被发现；Deslorelin +H⁺和+Na⁺加合物在1–100 ppm线性，而假定的铜结合物种平台或下降；Hyperchem分子力学模型显示L-pyroglutamyl残基位于左侧，L-tryptophan和D-tryptophan残基向顶部伸出，Clostripain切割位点被标注。

讨论部分总结：Deslorelin作为避孕药具有安全性高、副作用少、有效、可逆及适用于雌雄等优点，用于犬 fertility control、雪貂肾上腺疾病治疗和母马诱导排卵。但其醋酸制剂被怀疑有生殖毒性，列为Category 1B生殖毒物；作为GnRH激动剂，过量或不当处理可致LH和FSH初始升高，继而长期抑制性腺功能。雄性可出现睾酮暂时升高及行为改变或良性前列腺增生加重，雌性可出现雌二醇初始升高及发情表现，长期使用抑制生殖功能。Liman等报告Deslorelin处理犬睾丸osteopontin表达高于未处理成年犬，具有毒理学相关性；Pedula指出GnRH类似物治疗前列腺癌可发生睾酮“flare”，约20%患者骨痛加重；犬联合cyproterone注射有 regurgitation、腹泻等病例；长期治疗良性前列腺增生和尿失禁中约四分之一未去势雄犬出现flare，两只发生肿瘤，其中膀胱癌被认为与Deslorelin诱导的去势有关；幼犬研究显示Deslorelin处理雄性睾丸小管直径和生精上皮高度及组成显著降低，雌性卵巢结构无差异。治疗药物监测可确保血清浓度不超治疗水平，如山羊C_max83±28 ng/mL、稳态23.2 ng/mL。ELISA虽灵敏但特异性低、线性差；本方法利用串联四极杆质谱和MRM的低背景高特异性，并优化了Clostripain处理、提取效率、催化剂和GC-MS参数。里程碑包括：trientine因螯合铜提高ProNHEt产率；HCl提高氮吹回收；BHT提高总产率；血清提高Clostripain反应效率；pH 7.2–7.8最佳；ProNHEt-tBuDMS最特异稳定。研究人员认为可将本ProNHEt法与UPLC-ESI-MS/MS完整Deslorelin法结合，通过差减表征总降解产物；MALDI显示标准中已有氧化产物，铜结合影响尚未明确；氧化易发生在TRP、TYR、HIS等残基，TRP可形成自由基和 dimerization；本方法可扩展至buserelin、histrelin、leuprorelin和fertirelin等含ProNHEt的GnRH化合物，Clostripain消化效率约95%；但仅以牛血清为基质，未验证物种差异，尚未在临床样本和低水平加标中验证；单独ProNHEt不能区分其他含ProNHEt类似物，需依赖病史；直接UPLC-ESI-MS/MS测ProNHEt也可能绕过衍生化和GC-MS/MS。

研究结论部分翻译：总之，所提出的方法应为定量处理动物血清中以低浓度存在的GnRH类似物提供有用工具。确定通过ProNHEt替代标志物进行测定与单独用LC-MS/MS定量完整Deslorelin或其他以N-乙基修饰脯氨酸（ProNHEt）终止的GnRH类似物之间的对应程度将具有价值。本文所述验证工作大多聚焦于GC适用性；如果释放的ProNHEt直接用LC-MS/MS测定，其中许多工作将变得不那么重要。此类方法将使液液萃取回收率低不再成为问题，因为血清可简单进行蛋白沉淀，所得上清液可直接进样测定。观察Clostripain消化能够处理相对较大浓度的Deslorelin是有用的。然而，仍需在临床实际 incurred samples 和低水平加标中开展研究，以验证其对真实样品的适用性。