叶酸偶联白蛋白稳定金-铽纳米颗粒用于SPCCT/MRI双模态成像：体外细胞与体模研究

《International Journal of Nanomedicine》：Folic Acid-Conjugated Albumin-Stabilized Gold–Terbium Nanoparticles for SPCCT/MRI Imaging: An in vitro Cellular and Phantom Study

　　

三阴性乳腺癌因其生物学异质性和单模态成像的局限性，在成像方面仍面临挑战。多功能纳米颗粒可为光谱光子计数CT（SPCCT）和磁共振成像（MRI）提供互补对比度，有望改善多模态肿瘤成像。研究人员合成了叶酸偶联、白蛋白稳定的金-铽纳米颗粒（BSA@Au/Tb-FA），并使用透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线光电子能谱（XPS）和动态光散射（DLS）对其进行了表征。利用MDA-MB-231细胞，通过共聚焦显微镜和流式细胞术评估了体外细胞摄取、细胞毒性和血液相容性。在体模模型中评估了SPCCT和MRI性能。BSA@Au/Tb-FA纳米颗粒呈类球形形态，平均粒径约为10.68 ± 1.69 nm（n = 55）。在浓度高达250 μg/mL时，细胞活力仍保持在80%以上，半数抑制浓度（IC50）为352 μg/mL。血液相容性良好，在200 μg/mL浓度下，溶血值低于美国材料与试验协会（ASTM）安全阈值5%。在25、50和100 μg/mL浓度下，材料表现出浓度依赖性的细胞摄取，其中BSA@Au/Tb-FA纳米颗粒的摄取量高于非叶酸偶联的BSA@Au/Tb纳米颗粒（p < 0.05）。SPCCT显示BSA@Au/Tb-FA的衰减效率为38.35 HU·mL·mg-1，这归因于金（Au）和铽（Tb）组分在其K-edge能量附近强烈的X射线衰减。材料分解显示测量浓度与实际浓度之间存在高度一致性（R2 = 0.98）。MRI体模研究显示弛豫率值分别为r1 = 1.42 mM-1s-1和r2 = 13.82 mM-1s-1，表明其具有主导的横向弛豫效应和T2加权对比能力。BSA@Au/Tb-FA在体外表现出良好的血液相容性和生物相容性，在MDA-MB-231细胞中细胞摄取增强，并在体模条件下展现出互补增强的SPCCT/MRI对比度，支持其作为双模态成像剂的潜力。然而，由于细胞评估仅限于MDA-MB-231细胞且未进行受体阻断研究，因此增强的摄取不应被解释为已确认的叶酸受体介导的靶向作用。需要进一步的临床前和体内研究来确定靶向特异性、安全性和成像性能。

研究背景与意义

乳腺癌仍然是全球主要的健康挑战之一。据全球癌症观察站（GLOBOCAN 2022）估计，2022年全球约有230万新发乳腺癌病例和67万相关死亡病例。其中，三阴性乳腺癌（TNBC）约占全球乳腺癌病例的10-15%，由于其不表达雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2（HER2），因此治疗尤为困难，且疾病进展迅速、转移风险高、分子靶向治疗选择有限。这些特征凸显了对能够提供互补解剖学、功能学和定量信息的成像方法的迫切需求。

传统的成像方式如计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）各有优势但也存在局限。CT空间分辨率高、解剖细节好，但其传统造影剂主要是碘基小分子，循环时间短、剂量要求高、分子特异性有限。MRI软组织对比度优异，但在元素组成或定量材料区分方面提供的信息有限。单一成像模态无法完全表征疾病生物学特性，这促使了多模态成像探针的设计。光谱光子计数CT（SPCCT）通过检测单个X射线光子，能够基于能量依赖性衰减和K-edge特性实现改进的对比度和材料分解，这对高原子序数（高Z）纳米颗粒造影剂尤为重要。

重Z元素纳米颗粒，如金纳米颗粒（AuNPs），因其强X射线衰减和可调控的表面化学而备受关注。镧系元素纳米颗粒同样具有吸引力，因为多种镧系离子兼具高Z X射线衰减特性和可用于MRI的顺磁/超顺磁特性。将金与顺磁性镧系元素结合，为在单一纳米颗粒系统中整合光谱CT和MRI对比度提供了合理策略。叶酸受体（FR）介导的靶向是一种合理的主动癌细胞识别方法，因为叶酸受体在恶性细胞上经常过表达。尽管已有多种多功能纳米探针结合了CT和MRI，但此前报道的系统大多依赖传统CT衰减，而将牛血清白蛋白（BSA）稳定化、叶酸（FA）功能化、细胞评估以及定量SPCCT材料分解整合到单一平台的研究尚属空白。因此，研究人员设计了BSA@Au/Tb-FA系统，旨在将基于金/铽（Au/Tb）的SPCCT对比度、Tb相关的MRI弛豫、BSA介导的稳定化和FA相关的细胞摄取整合到一个单一平台中，用于MDA-MB-231 TNBC细胞的成像。

主要关键技术方法

1. 1.
   纳米颗粒合成与表征：采用室温合成法制备BSA@Au/Tb-FA纳米颗粒，并通过透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线光电子能谱（XPS）、动态光散射（DLS）和电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）对其形貌、尺寸、晶体结构、表面化学、水合粒径、zeta电位及元素浓度进行全面表征。
2. 2.
   体外生物相容性与细胞摄取评估：利用ATP发光法细胞活力测定评估对MDA-MB-231细胞的细胞毒性；通过分光光度法测定人红细胞（hRBCs）的溶血率评估血液相容性；使用荧光显微镜和流式细胞术评估FITC标记纳米颗粒在MDA-MB-231细胞中的摄取情况。
3. 3.
   MRI体模成像：在临床3T MRI扫描仪上，使用饱和恢复自旋回波序列获取不同Tb浓度下的T₁和T₂弛豫映射图像，计算纵向弛豫率（r₁）和横向弛豫率（r₂）。
4. 4.
   SPCCT体模成像与材料分解：使用MARS Microlab SPCCT扫描仪对不同浓度的BSA@Au和BSA@Au/Tb-FA纳米颗粒进行成像，分析不同能量窗口下的亨氏单位（HU）值，并利用MARS MD软件进行材料分解分析，比较测量浓度与实际浓度。

研究结果

理化性质表征：TEM图像显示BSA@Au/Tb-FA纳米颗粒呈类球形，平均粒径为10.68 ± 1.69 nm。选区电子衍射（SAED）图案显示了金的（111）、（200）、（220）和（311）晶面衍射环。高角度环形暗场扫描透射电镜能谱分析（HAADF-STEM-EDX）元素分布图显示Au和Tb元素均匀分布。DLS测得的水合粒径为84.41 nm（多分散指数PDI=0.292），zeta电位为+31.1 mV，表明胶体稳定性良好。XRD图谱证实了金的存在。XPS分析证实了FA的成功偶联，且不影响金核的金属态。

细胞毒性与溶血效应评估：溶血实验表明，在高达200 μg/mL浓度下，BSA@Au/Tb和BSA@Au/Tb-FA的最大溶血率分别为4.9%和4.4%，均低于美国材料与试验协会（ASTM）F756-17标准推荐的5%安全阈值，显示出良好的血液相容性。细胞活力实验显示，两种材料均呈现浓度依赖性细胞活力，在250 μg/mL浓度以下细胞活力保持80%以上。BSA@Au/Tb和BSA@Au/Tb-FA的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为397.7 μg/mL和352.4 μg/mL，两者置信区间重叠，表明细胞毒性相当。

MRI实验：MRI体模研究显示，随着Tb浓度增加，T₁恢复信号强度和T₂衰减信号强度均增加。弛豫率与Tb浓度呈线性关系，计算得到r₁=1.42 mM^-1s^-1和r₂=13.82 mM^-1s^-1，r₂/r₁比值约为9.7，表明以横向弛豫效应为主，支持其作为T₂加权MRI造影剂的潜力。

X射线光谱光子计数CT成像：SPCCT成像显示，X射线衰减随浓度增加而增强，并随能量窗口变化。BSA@Au/Tb-FA复合材料的信号强度高于BSA@Au，这归因于Tb的X射线衰减贡献。在低能量窗口（7-33 keV）衰减最强。BSA@Au/Tb-FA在第二（33-49 keV）和第五（65-118 keV）能量窗口观察到信号跃升，分别对应Tb（约52 keV）和Au（约81 keV）的K-edge能量。HU值与浓度呈良好线性关系，BSA@Au和BSA@Au/Tb-FA的衰减效率分别为约34.96 HU·mg^-1·mL和约38.35 HU·mg^-1·mL。材料分解分析显示测量浓度与实际浓度之间存在强线性相关性（R²=0.98），证明了MARS CT材料分解算法的准确性。

细胞摄取研究：共聚焦显微镜图像显示，与未处理对照组相比，经BSA@Au/Tb和BSA@Au/Tb-FA处理的MDA-MB-231细胞内均可见绿色荧光，表明纳米颗粒被内化。流式细胞术定量分析显示，两种纳米颗粒的摄取均呈浓度依赖性。在25、50和100 μg/mL浓度下，BSA@Au/Tb-FA的平均荧光强度（MFI）显著高于BSA@Au/Tb，分别高出约2.30倍、2.42倍和2.09倍，表明叶酸偶联增强了细胞摄取。

讨论与结论

研究表明，BSA@Au/Tb-FA纳米颗粒在体外具有良好的血液相容性和生物相容性，在MDA-MB-231细胞中展现出增强的细胞摄取，并在体模条件下表现出互补增强的SPCCT/MRI对比度。研究结论指出，这项工作展示了叶酸偶联的BSA稳定的Au/Tb纳米颗粒作为一种光谱CT/MRI双模态成像剂，用于过表达叶酸受体的癌细胞靶向成像。该纳米颗粒系统通过提供一个高度特异性、生物相容性好且多功能的成像平台，解决了当前成像模态的关键局限性。这种新方法为推进癌症诊断和管理带来了巨大希望，并为未来的临床应用奠定了坚实基础。然而，研究也承认了其局限性：生物学评估仅限于单一癌细胞系（MDA-MB-231），未使用非恶性细胞对照；未通过受体阻断研究或使用叶酸受体阴性细胞系验证叶酸受体介导的摄取；细胞实验仅使用了技术重复而非独立生物学重复；SPCCT和MRI成像性能仅在体模模型中评估，未进行体内研究。因此，未来研究将进行体内动物模型验证，包括生物分布、肿瘤积累、药代动力学、清除曲线、长期毒性及安全性等。