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有尾噬菌体（tailed bacteriophages）可借助穿孔素-内溶素系统（holin-endolysin system）裂解其宿主。然而，对于感染细胞包膜结构根本不同的古菌有尾病毒（archaeal tailed viruses, arTVs），其裂解
有尾噬菌体（tailed bacteriophages）可借助穿孔素-内溶素系统（holin-endolysin system）裂解其宿主。然而，对于感染细胞包膜结构根本不同的古菌有尾病毒（archaeal tailed viruses, arTVs），其裂解机制尚属未知。本研究以模式古菌病毒-宿主系统——感染产甲烷菌纲（methanobacteriote）Haloferax gibbonsii LR2-5的Haloferax有尾病毒1（HFTV1）为对象，鉴定并表征了裂解蛋白GP33——一种与细菌穿孔素（holin）无序列同源性的小分子膜蛋白。过表达该蛋白可导致细胞裂解，且该蛋白在细胞包膜附近形成聚集点（foci）。分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟表明，该蛋白可形成排斥脂质的孔道，这可能进而导致细胞裂解。确实，原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）显示，GP33可在膜上形成孔道，且在高浓度下导致膜完全崩解。本研究在分子水平上揭示了有尾古菌病毒的裂解机制。
论文解读
一、研究背景与科学问题
病毒在完成子代装配后，必须穿越宿主细胞包膜才能释放到细胞外。细菌、古菌和真核生物的病毒因宿主细胞壁组成不同而演化出各异的释放策略。细菌通常具有由胞壁质（murein）构成的细胞壁，大多数双链DNA（dsDNA）噬菌体依赖穿孔素-内溶素系统（holin-endolysin system）裂解宿主：穿孔素（holin）是小分子膜蛋白，可 destabilize 细菌膜；内溶素（endolysin）则降解细菌细胞壁聚合物胞壁质。此外还存在pinholin-signal-arrest-release（SAR）内溶素系统及其他辅助裂解蛋白。而小型的裂解性细菌病毒（单链RNA和DNA染色体）则利用单一裂解基因（Sgl）干扰细胞壁合成或完整性。
古菌细胞包膜不含胞壁质，因此典型的细菌穿孔素-内溶素系统在古菌中无法发挥功能。部分产甲烷古菌具有类似细菌胞壁质的假胞壁质（pseudomurein）层，已有三个前噬菌体（ΨM1、ΨM100和φmru）被发现编码内切异肽酶（endoisopeptidases）PeiW、PeiP和PeiR，可切割假胞壁质的肽链，但这些酶如何穿越古菌细胞膜以及如何支持病毒释放仍不清楚，因为这些古菌病毒基因组中未鉴定出穿孔素同源物。迄今为止，仅有一个古菌病毒裂解机制在分子水平上得到详细描述——金字塔形逸出结构（pyramidal egress structures）机制，但受感染的宿主仅限于热变形菌目（Thermoproteales）。因此，感染其他古菌门类的古菌病毒如何引起细胞裂解仍不清楚。
古菌有尾病毒（arTVs）是感染产甲烷菌纲（Methanobacteriati）的主要病毒分离物，形态上与有尾dsDNA噬菌体相似，基因组组织方式也类似，但在序列水平上与噬菌体或其他arTVs几乎没有同源性。HFTV1（Haloferuviridae科，Kirjokansivirales目，Caudoviricetes纲）具有siphovirus样形态，基因组38 kb，编码80个蛋白，潜伏期约6小时，感染导致宿主膜完全崩解和培养物澄清。鉴于arTVs目前占分离古菌病毒的大多数，阐明其裂解机制对理解古菌病毒生物学具有重要意义。
二、研究内容与主要结论
研究人员以HFTV1为模型，系统鉴定了其裂解蛋白并阐明了裂解机制。通过筛选HFTV1基因组中晚期表达的未知功能基因，发现GP33和GP34两个小分子跨膜蛋白在嗜盐古菌中过表达时具有毒性。进一步研究表明，GP33单独过表达即足以诱导Hfx. volcanii细胞裂解，而GP34单独表达不引起液体培养中OD下降。GP33在细胞包膜附近形成聚集点（foci），N端GFP融合保留毒性表型，C端GFP融合则阻断裂解功能。生化分析显示GP33以单体和二聚体形式存在，二聚化可由二硫键介导。分子动力学（MD）模拟（全原子和粗粒化）表明GP33单体可嵌入膜中，多个单体可自发寡聚化形成直径约5-6 nm的充满水的环形孔道结构，脂质从组装体内部被排斥。高速原子力显微镜（HS-AFM）实验直接可视化证实了GP33在脂质双分子层中形成孔道，且高浓度下导致膜完全失稳崩解。丙氨酸扫描突变鉴定出关键功能残基：C16S和I74A突变完全丧失裂解功能，E75A、D77A和Q84A突变在低诱导浓度下功能减弱。该研究首次在分子水平上揭示了有尾古菌病毒的裂解机制：GP33作为一种新型单蛋白孔道形成因子，独立完成宿主裂解和病毒释放，无需内溶素辅助，这与细菌噬菌体依赖穿孔素-内溶素系统的机制形成鲜明对比。
三、关键技术与方法
本研究采用多模态研究方法。主要技术包括：基于色氨酸诱导启动子的古菌毒性基因筛选系统（在Hfx. volcanii H26和Hfx. gibbonsii S5-15中进行）；AlphaFold 3结构预测结合PDBsum分析；全原子（AA）和粗粒化（CG）分子动力学模拟（使用GROMACS、CHARMM和Martini 3力场，POPC膜模型）；高速原子力显微镜（HS-AFM）实时成像（DOPC:DOPE:DOPG 6:3:3支持脂质双分子层）；荧光显微镜定位分析（GFP融合标签）；截短突变和丙氨酸扫描定点突变；尺寸排阻色谱（SEC）和Western blot寡聚化分析；微流控芯片时间推移显微镜。病毒株HFTV1源自塞内加尔Retba湖，宿主为Hfx. gibbonsii LR2-5。
四、研究结果
GP33和GP34在嗜盐古菌中具有毒性。 研究人员利用已发表的HFTV1转录组数据，选取16个晚期表达基因和4个未知功能基因，克隆至色氨酸诱导表达载体pTA1392并转化Hfx. volcanii H26进行毒性筛选。结果显示GP33转化子在含诱导剂的平板上完全无法生长，GP34转化子生长减少92%。GP33和GP34在基因组上相邻，有17 bp重叠，作为一个双顺反子操纵子共转录。DeepTMHMM预测GP33有两个跨膜结构域（TMD），GP34有一个TMD和N端信号肽。DALI、psi-BLAST和FoldSeek分析均未发现显著序列或结构同源物，表明这是一种新型病毒裂解蛋白。
GP33过表达导致细胞裂解。 液体培养中，表达GP33或GP33/34的细胞在诱导后约20分钟出现OD600下降，培养物澄清并出现肉眼可见的絮状物。GP34单独表达不引起OD下降。在天然宿主Hfx. gibbonsii S5-15中也验证了相同表型。因此GP33单独过表达即足以诱导细胞裂解。
GP33截短导致蛋白失活。 研究人员构建了缺失C端10、20、30、40个残基（ΔC10、ΔC20、ΔC30、ΔC40）和N端10个残基（ΔN10）以及缺失TMD1或TMD2的突变体。除ΔC10表现出初始裂解后细胞恢复生长外，其余所有截短突变体均完全丧失裂解功能。AlphaFold 3预测GP33由三个α-螺旋区和一个四链β-折叠片构成，截短突变导致预测结构改变，可能解释其功能丧失。
丙氨酸扫描揭示关键功能残基。 研究人员基于AlphaFold 3预测结构（含油酸模拟膜环境）和PDBsum分析，选取14个位于疏水β-折叠片或C端的氨基酸进行丙氨酸扫描。结果显示C16S和I74A突变在高浓度诱导条件下完全丧失裂解功能；E75A、D77A和Q84A突变在低浓度（0.1 mM）色氨酸条件下功能减弱。位于疏水β-折叠片的突变更可能导致裂解功能降低。
显微镜分析表明细胞通过完全破裂裂解。 相差显微镜显示，表达GP33的细胞在诱导2小时后76%发生裂解，表现为完全细胞破裂和碎片堆积。微流控时间推移实验显示细胞裂解异步发生，每次裂解事件均导致完全细胞破裂，诱导后细胞生长停滞随后立即裂解。对照培养物无裂解细胞。
荧光显微镜显示GP33在细胞包膜附近形成聚集点。 N端GFP融合的GP33保留毒性表型，在细胞周边形成GFP信号聚集点（foci），裂解效率为44%（天然蛋白为76%）。C端GFP融合的GP33丧失毒性，GFP信号均匀分布于细胞质中，Western blot显示该融合蛋白在膜组分中有全长条带，但细胞质中也有游离GFP（蛋白加工产物）。这表明C端GFP可能阻断膜相关多聚化（缺乏foci形成），而N端GFP不干扰功能。
SEC和Western blot显示GP33以单体和二聚体形式存在。 通过pBAD24阿拉伯糖诱导系统在E. coli中异源表达并纯化GP33-8xHis，SEC显示两个分离峰，非还原SDS-PAGE和Western blot显示单体（~13 kDa）和二聚体（~26 kDa）两种形式。补充DTT（二硫苏糖醇）后仅剩单体，表明GP33通过第16位半胱氨酸形成二硫键介导二聚化。
MD模拟表明GP33可能形成膜孔。 全原子模拟中，单个GP33单体稳定嵌入POPC双分子层，β-折叠片基部亲水残基导致附近磷脂头基向内位移，形成局部膜变薄，并沿β-折叠片外表面形成连续水通道。5个单体嵌入膜后，相邻β-折叠片在约500 ns后关联形成连续β-桶状组装体，脂质从组装体内部被排斥，120 ns后形成内径约5 nm的闭合环状结构，充满水，形成膜孔，并在2 μs模拟中保持稳定。粗粒化模拟中16个单体在约100 ns内形成内径约6 nm的闭合水填充孔道，三次独立重复均观察到一致的寡聚化行为。20个单体从溶液相自发插入实验在2 μs内未观察到自发插入，仅9个单体保持膜结合状态。
HS-AFM揭示GP33的膜失稳机制。 在DOPC:DOPE:DOPG（6:3:3）支持脂质双分子层上，加入500 nM GP33后观察到膜表面结构进行性改变：先出现瞬态孔样缺陷，随后迅速发展为密集的细长纤维状结构，最终形成高阶聚集体并伴随膜完全失稳。在50 nM低浓度孵育5分钟后洗去游离蛋白的"冻结"实验中，观察到少量膜插入的GP33分子和孔道。膜插入分子在膜表面上方突出约0.8 nm，GP33-脂质纤维平均高度6.1 nm（高于膜面约0.7 nm）。膜插入的GP33分子可自发诱导局部膜缺陷，孔道旁的分子总是以多聚体状态存在。这些结果实验证实了GP33在无任何辅助蛋白的情况下形成膜孔并导致膜完整性完全破坏。
五、讨论与结论
研究人员提出GP33介导的裂解机制模型：感染后期GP33表达并在细胞膜积累，通过α-螺旋TMD锚定于膜内叶，单体相互作用形成二聚体及可变大小的寡聚体，在膜上形成聚集斑块。寡聚化导致环状结构形成，蛋白借助插入膜的疏水β-链局部排斥脂质，组装成β-桶形成孔道。由于Haloferax S层蛋白通过脂质锚定于细胞膜，孔道形成可能局部破坏S层，最终在渗透压作用下导致细胞快速"爆裂"裂解，释放成熟病毒粒子。
GP33单独即可完成病毒释放，这与细菌噬菌体释放必需穿孔素-内溶素系统形成根本区别。GP34在实验室条件下对裂解有轻微增强作用，但非必需。研究人员推测细菌胞壁质与古菌S层的差异可能是这种机制差异的根源。GP33的预测拓扑结构与穿孔素相似，但其β-折叠片组装成β-桶形成孔道的特征与gasdermin蛋白（参与哺乳动物焦亡的孔道形成蛋白，由约27-33个单体组装成约20 nm的β-桶孔道）具有表面可比性。GP33的裂解机制在表面上类似于细菌穿孔素-内溶素系统（使用小分子裂解膜蛋白），但本质不同（单一孔道形成蛋白独立作用vs.与内溶素协同作用）。这项研究首次为有尾古菌病毒的潜在分子裂解机制提供了见解，可能启发未来对古菌病毒裂解的研究，探索单一蛋白介导裂解是否为裂解性古菌病毒的保守特征。
研究结论
本研究鉴定并表征了HFTV1编码的裂解蛋白GP33——一种小分子孔道形成膜蛋白，能够在其古菌宿主中引起细胞裂解。GP33通过插入细胞膜、寡聚化形成排斥脂质的β-桶孔道，进而导致膜完全失稳和细胞破裂，从而独立完成病毒释放。该机制与细菌噬菌体的穿孔素-内溶素系统在分子水平上存在根本差异，为理解有尾古菌病毒的裂解策略提供了首个分子层面的详细描述。
