共济失调蛋白-2下调重塑神经元和星形胶质细胞代谢以对抗TDP-43毒性

《Cell Reports》：Ataxin-2 downregulation rewires neuronal and astrocytic metabolism to protect against TDP-43 toxicity

　　

重点摘要• ataxin-2下调通过重编程代谢而非逆转TDP-43损伤来发挥作用• 神经元和星形胶质细胞各自启动不同的、依赖ataxin-2的保护性程序• 神经元中的IDH1和星形胶质细胞中的HMGCS1驱动不同的保护性通路• ataxin-2下调可同时挽救TDP-43功能获得性和功能丧失性毒性

摘要

Ataxin-2（ATXN2）是TDP-43毒性的遗传修饰因子，也是肌萎缩侧索硬化症（ALS）中有前景的治疗靶点。然而，其神经保护作用的机制仍知之甚少。通过在酵母和小鼠TDP-43模型中进行全蛋白质组谱分析，我们证实pbp1/ataxin-2（pbp1是酵母ataxin-2的同源物）减少通过激活神经元和胶质细胞中各自独立的应激适应性通路来发挥神经保护作用，而非简单地逆转TDP-43引起的损伤。在神经元中，ataxin-2下调激活糖酵解和由IDH1驱动的还原性谷氨酰胺羧化反应，在不依赖受损线粒体的情况下恢复ATP产生。在星形胶质细胞中，它通过HMGCS1上调胆固醇合成，增强对神经元的神经营养支持。完整的神经保护作用需要两种机制同时参与：只有在神经元-星形胶质细胞共培养体系中同时减少ataxin-2时，神经元存活才得到完全挽救。重要的是，ataxin-2下调可同时保护免受TDP-43功能获得性和功能丧失性毒性的影响，拓展了其治疗意义。总之，这些发现确立了ataxin-2作为应激适应性代谢韧性的调控因子。

图文摘要

引言

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种进展迅速且致命的神经退行性疾病，特征为上运动神经元和下运动神经元丧失，确诊后典型存活期为2至5年。现有的ALS治疗手段大多为姑息性，疗效至多为中等程度，凸显了对有效疗法的重大未满足需求。ALS的病理定义特征为RNA结合蛋白TDP-43的核内耗竭和胞质内聚集。这两种病理特征均被患者数据和人类遗传学证据证实与ALS发病机制相关。胞质TDP-43聚集体对细胞有毒性作用，且使TDP-43朊蛋白样结构域更易于聚集的变异体可导致ALS。相反，核内TDP-43的丧失则导致mRNA多聚腺苷酸化失调和隐匿性外显子的异常包含。功能丧失和功能获得机制之间的这种相互作用使TDP-43极难成为治疗靶点。绕过这一挑战的一种有前景的策略是针对TDP-43的遗传修饰因子，这些因子无论哪种TDP-43病理机制占主导地位都能赋予细胞保护。

ataxin-2（ATXN2）中27至33次重复的中间长度多聚谷氨酰胺扩展与多种人类群体中ALS风险增加相关，确立其为该病的一种常见遗传风险因子。Ataxin-2已被鉴定为TDP-43毒性的强效遗传修饰因子，在酵母、果蝇和小鼠ALS模型中进行的临床前研究表明，降低野生型ATXN2同源物的水平可提供针对TDP-43相关细胞毒性的强效保护。这些发现使ataxin-2下调成为ALS的一种有前景的治疗策略，并已启动了一项靶向ATXN2的反义寡核苷酸（ASO）临床试验。该临床试验在未显示临床获益的情况下被中止，可能反映了中枢神经系统（CNS）中靶点结合不充分，证据为在脑脊液（CSF）中仅观察到ataxin-2的温和减少（J. Ravits，2024年6月19日在第20届ENCALS会议上演讲，未发表数据）。此类结果与临床前研究（包括本研究）形成鲜明对比，后者中治疗性挽救通常以ataxin-2的强效敲低或基因消融为前提。

尽管存在这种治疗兴趣，野生型ataxin-2下调赋予神经保护作用的细胞机制仍未得到阐明。在这里，我们表明ataxin-2下调并非简单地逆转TDP-43引起的分子损伤。相反，它激活适应性代谢程序，超越了简单逆转TDP-43诱导损伤的范畴，涵盖了细胞自主性的神经元重编程和非细胞自主性的胶质细胞适应。在神经元中，我们鉴定出糖酵解和还原性谷氨酰胺羧化反应驱动ATP产生被激活，以补偿受损的线粒体。在星形胶质细胞中，我们鉴定出胆固醇合成上调，增强对神经元的神经营养支持。完整的神经保护作用需要两种机制：只有在神经元-星形胶质细胞共培养环境中减少ataxin-2时，神经元存活才得到完全挽救。我们通过酵母和小鼠TDP-43模型中的蛋白质组谱分析建立了这一框架，随后在原代神经元和神经元-星形胶质细胞共培养体系中进行功能验证。我们进一步表明，ataxin-2下调可保护免受TDP-43功能获得性和功能丧失性毒性的影响，拓展了其机制和治疗相关性。总之，这些发现将ataxin-2重新定义为应激适应性代谢可塑性的调控因子，鉴定了异柠檬酸脱氢酶（NADP(+)）1（IDH1）和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶1（HMGCS1）为下游效应分子，并突出了靶向中枢神经系统代谢在对抗神经退行性变方面的潜力。

结果

Pbp1和ataxin-2丧失影响与TDP-43毒性不同的细胞通路

人类ATXN2的酵母同源物是pbp1。此前已确立并描述了pbp1敲除对酿酒酵母中TDP-43表达毒性的保护作用。该酿酒酵母模型基于半乳糖诱导型人类TDP-43过表达，导致TDP-43聚集和细胞毒性，在异源系统中重现TDP-43蛋白病的关键方面。为了更好地理解发挥作用的保护机制，我们在指数生长期，TDP-43表达诱导8小时后，对pbp1Δ和野生型酵母培养物进行了全面的全蛋白质组分析（表S1）。我们的初步观察显示，酵母细胞中TDP-43的表达导致蛋白质总体呈下调趋势。对TDP-43显著下调的蛋白质进行分析发现了一组线粒体蛋白质（包括ATP合酶亚基）和核糖体蛋白（图1A）。在TDP-43应激下删除pbp1改变了线粒体内膜蛋白、三羧酸循环相关蛋白和线粒体翻译蛋白的表达。有趣的是，pbp1Δ触发了特征为过氧化物酶体蛋白（包括脂肪酸氧化酶）丰度增加的代谢转换（图1B）。酵母细胞通常在葡萄糖受限或能量需求超过糖酵解能力时诉诸过氧化物酶体脂肪酸氧化。这种代谢重编程提示pbp1Δ细胞通过多样化其能量产生途径来适应TDP-43诱导的细胞应激。代谢重编程反应是应激依赖性的，因为在对照GFP表达酵母中删除pbp1产生了不同的蛋白质组反应（图S1；表S1）。我们的酵母发现指向pbp1Δ对TDP-43保护作用的两个关键方面：首先，pbp1删除并非通过简单逆转受TDP-43毒性影响的通路来挽救酵母，而是诱导了一种不同的代谢通路，赋予细胞在应激条件下的韧性（图1C）。其次，鉴于神经元在代谢上并非独立于其周围的胶质细胞，这种代谢重编程凸显了在哺乳动物细胞神经保护的语境中需要考虑ataxin-2下调的非细胞自主性效应的必要性。

图1 Pbp1Δ和ataxin-2下调在TDP-43表达时诱导保护性代谢通路

(A和B) 差异表达蛋白质的火山图（质谱法；调整后p = 0.05虚线），比较表达TDP-43与GFP对照的野生型（A）或pbp1Δ（B）酵母，按DAVID基因本体组成部分着色。n = 4–5（A），n = 3–4（B）。

(C) pbp1Δ（y轴）与TDP-43表达（x轴）对蛋白质丰度的影响。显示调整后p < 0.05的蛋白质；括号内为每个类别中显著变化的蛋白质数量。

(D) TAR4/4与野生型小鼠第五层运动皮层中差异表达蛋白质的火山图（质谱法；p调整后<0.01），按IPA通路着色。每组4只雄性小鼠。

(E) 散点图比较第五层皮层中疾病相关蛋白质变化（x轴：TAR4/4 vs. 野生型，均为对照ASO）与ataxin-2下调效应（y轴：TAR4/4 Atxn2 ASO vs. TAR4/4对照ASO）。显示显著改变的蛋白质（p调整后<0.01，质谱法）。每组4只雄性小鼠。

(F) TAR4/4小鼠第五层运动皮层中差异表达蛋白质的火山图，Atxn2 ASO vs. 对照ASO（质谱法，p调整后<0.01），按通路着色。每组4只雄性小鼠。

Ataxin-2下调在ALS小鼠脑中激活正交的代谢通路

为了进一步定义ataxin-2下调激活的细胞通路，我们在接受靶向ataxin-2的ASO治疗的TAR4/4 ALS模型小鼠脑组织中进行了全面的蛋白质组谱分析。TAR4/4小鼠是ALS相关神经退行变的标准模型，表现为由TDP-43过表达驱动的严重致死表型和运动功能下降。此外，该模型此前已被验证为对Atxn2靶向ASO注射有应答的模型，因此提供了研究Atxn2-TDP-43遗传相互作用机制的合适模型。与酵母中的pbp1类似，ataxin-2下调在TAR4/4 ALS模型小鼠中挽救了神经退行变并延长了寿命（图S2A和S2B）。第五层皮层与ALS的特殊相关性及其存在神经退行变（图S2C）但细胞死亡程度有限（图S2D）的特点，为探究促凋亡细胞过程提供了机会；因此，我们通过微解剖第五层皮层进行空间分辨蛋白质组分析，并使用高灵敏度方法分析这些样品。由于第五层包含神经元、胶质细胞和血管细胞等异质性细胞群体，而非纯神经元群体，我们并行进行了细胞类型标志物分析，以辅助解读检测到的蛋白质组变化（图S3B和S3C）。该分析未显示TAR4/4小鼠接受对照ASO与Atxn2 ASO处理之间在标志物组成上存在明显的层级差异，提示ASO处理不会导致整体细胞类型组成发生实质性变化。

蛋白质组分析（表S2）显示TAR4/4第五层中存在蛋白质表达的强烈失调。Ingenuity通路分析（IPA）鉴定出蛋白质泛素化和含帽内含子的前mRNA加工为主要上调通路，而突触发生和胆固醇合成通路则在最显著下调的通路中名列前茅（图1D；表S2）。在检查TAR4/4小鼠中对ataxin-2下调的细胞反应时，我们检测到TAR4/4相关失调的部分逆转，同时也观察到该疾病模型中未出现的正交性蛋白质变化（图1E）。这与我们的酵母发现一致，即pbp1丧失的效应主要与TDP-43毒性不同。在TAR4/4小鼠中，ataxin-2沉默主要导致蛋白质上调。TAR4/4中ataxin-2丧失导致上调的蛋白质包括参与糖酵解的酶（TPI1、PGAM1和ENO2）、还原性谷氨酰胺羧化通路的酶（GOT1和IDH1）、HMGCS1（甲羟戊酸胆固醇合成通路中的关键酶），以及甲硫氨酸降解通路的组分（CTH、AHCY、EEF1AKMT1和MAT2A）（图1F）。上调的烯醇酶为神经元特异性亚型ENO2，提示糖酵解的上调特异性地发生在神经元中，代表一种细胞自主性的保护机制。胆固醇和甲硫氨酸降解通路的上调尤其令人感兴趣，因为这些过程主要在脑内的星形胶质细胞中发生。鉴于第五层微解剖不可避免地包含除神经元和星形胶质细胞以外的混合细胞群体，我们进行了细胞类型标志物分析，以评估观察到的蛋白质组变化能否由Atxn2 ASO处理后细胞类型组成的变化来解释（图S3A和S3B）。该分析未显示对照和Atxn2 ASO处理的TAR4/4小鼠之间在细胞类型标志物丰度上存在明显的层级差异，提示蛋白质组变化不太可能是主要由细胞组成变化驱动的。这一观察结果支持这样的解读：ataxin-2下调可能通过调节星形胶质细胞蛋白质表达来赋予神经保护，揭示了一种超越直接神经元效应的潜在非细胞自主性保护机制。最后，在野生型小鼠中仅有24种蛋白质对ataxin-2下调有应答（图S4；表S2），且全部为下调，表明ataxin-2丧失的代谢效应是应激依赖性的。

Ataxin-2丧失通过神经元细胞自主性和星形胶质细胞非细胞自主性方式保护神经元

为了探究蛋白质组分析所鉴定的通路，我们建立了原代皮层神经元中TDP-43毒性的体外模型，以NeuN+细胞计数作为神经元存活的定量终点。TDP-43过表达未在这些细胞中导致可检测到的TDP-43聚集。皮层上运动神经元是ALS中神经退行变的关键细胞靶点之一，初级运动皮层相应地表现为区域葡萄糖代谢降低，18F-FDG-PET（18F-氟代脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描）成像已证实这一点。原代皮层神经元中TDP-43过表达诱导了显著的毒性和细胞死亡（图2A和2B），伴随严重的线粒体功能障碍，表现为耗氧率（OCR）降低和ATP产生减少（图2C和2D），与既往发现一致。虽然用靶向Atxn2的ASO处理原代神经元可强烈降低Atxn2水平（图S5A），但仅产生微小且无统计学意义的神经元存活改善（图2A和2B），并未改善OCR（图2C）；然而，它增加了总ATP产生（挽救效应约50%）（图2D）。

然而，当神经元与星形胶质细胞共培养时，对共培养体系使用Atxn2 ASO处理恢复了神经元的存活率（图2E和2F；图S5B），表明ataxin-2的下调通过细胞自主性神经元机制和非细胞自主性星形胶质细胞途径发挥保护作用。

图2 Ataxin-2下调通过细胞自主性和非细胞自主性效应促进体外神经元健康

(A和B) GFP-或TDP-43过表达条件下，使用非靶向(NT)或Atxn2 ASO处理的初级神经元存活率（NeuN+）定量分析（A）和代表性图像（B）。以GFP + NT ASO条件进行归一化。(C) 使用NT或Atxn2 ASO处理的GFP-或TDP-43过表达神经元在不同时间点的耗氧率（OCR，pmol min?1）。(D) 使用NT或Atxn2 ASO处理的过表达TDP-43的初级神经元总ATP产生速率，与使用NT ASO处理的GFP对照神经元相比。ATP产生速率以细胞数量进行归一化，并以GFP + NT ASO条件为相对参考。(E) GFP-或TDP-43过表达条件下，使用NT或Atxn2 ASO处理的神经元与星形胶质细胞共培养体系中神经元存活率定量分析。数据以GFP + NT ASO条件进行归一化。(F) 与星形胶质细胞共培养且经NeuN标记的神经元代表性图像，即(E)中定量的内容。(G) 在对照(shRNA Scramble)或TDP-43缺失(shRNA TARDBP)条件下，使用NT或Atxn2 ASO处理的初级神经元存活率。(H) 经NeuN标记的神经元代表性图像，即(G)中定量的内容。(I) 在对照(shRNA Scramble)或TDP-43缺失(shRNA TARDBP)条件下，使用NT或Atxn2 ASO处理的神经元与星形胶质细胞共培养体系中神经元存活率定量分析。数据以对照 + NT ASO条件进行归一化。(J) 与星形胶质细胞共培养且经NeuN标记的神经元代表性图像，即(I)中定量的内容。

所有数据均为均值±标准误；统计显著性通过双因素方差分析结合Tukey多重比较检验(A)或?idák多重比较检验(E、G和I)评估，或通过单因素方差分析结合?idák多重比较检验(D)评估，其中*p校正后<0.05，***p校正后<0.001，****p校正后<0.0001；ns表示无显著性差异；比例尺为200 μm。

**Ataxin-2下调保护神经元免受TDP-43功能丧失毒性**

我们观察到ataxin-2敲低广泛改善了细胞存活率，不仅延长了TDP-43过表达细胞的存活时间，也延长了对照GFP表达细胞的存活时间（图2）。我们进一步证实实验中作为对照使用的GFP表达不影响神经元活力，且Atxn2 ASO在 na?ve（未处理）培养物中发挥相同的促存活效应（图S6A和S6B）。由于即使是na?ve培养物也受到基线体外应激，这表明ataxin-2下调赋予的促存活效应超出了TDP-43过表达毒性。接下来我们测试了这种保护作用是否延伸至TDP-43功能丧失毒性。Ataxin-2下调部分挽救了TDP-43缺失导致的神经元存活率降低，且该效应在神经元-星形胶质细胞共培养中强于单独的神经元培养（图2G–2J）。鉴于核TDP-43缺失是肌萎缩侧索硬化症(ALS)病理的标志性特征，这一发现尤为重要，表明ataxin-2下调可以保护神经元免受TDP-43功能失调的双向危害（功能获得和功能丧失），这是一个在功能获得和功能丧失机制并存疾病中的关键优势。

**Ataxin-2下调在体外挽救神经元ATP产生**

我们对TAR4/4小鼠第五层进行蛋白质组学分析表明，ataxin-2下调导致糖酵解和还原性谷氨酰胺羧化途径相关酶上调。糖酵解增强可以为线粒体受损的细胞提供能量，而还原性谷氨酰胺羧化通过NADH穿梭进一步支持糖酵解。耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)——分别反映线粒体呼吸和糖酵解产生的质子生成——在过表达TDP-43的神经元中均受损（图2C、3A和3B）。Ataxin-2缺失对OCR无影响，但挽救了糖酵解ATP产生速率（约41%的挽救）和ECAR，表明ataxin-2减少刺激神经元通过糖酵解产生更多ATP（图3A），而非通过修复线粒体功能障碍。为证明这些代谢效应由还原性谷氨酰胺羧化途径支持，我们沉默了该途径的关键酶IDH1（图S7A）。这完全消除了ataxin-2下调对ATP产生和ECAR的挽救效应（图3C和3D）。为进一步测试激活的还原性谷氨酰胺羧化是否能在体外增强神经元ATP合成和存活，我们过表达了IDH1（图S7B）。仅IDH1过表达就足以增加通过糖酵解的ATP产生（约46%的挽救）（图3E和3F）以及神经元存活率（图3G；图S7C），验证了我们的假设。值得注意的是，在初级神经元培养中，IDH1过表达提供的神经元存活益处大于ataxin-2敲低，这可能反映了过表达所达到的更高IDH1蛋白水平（使用 commercially available 抗体通过western blot无法检测到IDH1蛋白）。总之，这些数据表明ataxin-2下调在体外通过激活糖酵解和还原性谷氨酰胺羧化，保护神经元免受TDP-43诱导的线粒体功能障碍，从而使神经元能够合成ATP（图3I）。此外，它们表明IDH1是该途径中一个特别有效的下游效应因子。

图3 神经元中ataxin-2减少通过还原性谷氨酰胺羧化和糖酵解增强ATP合成，促进其存活

(A和B) 使用NT或Atxn2 ASO处理的GFP-或TDP-43过表达神经元的糖酵解ATP(glycoATP)产生速率（A，pmol/min）和细胞外酸化率(ECAR)（B）。(C和D) 使用NT或Atxn2 ASO以及Idh1 siRNA处理的GFP-或TDP-43过表达神经元的糖酵解ATP（C）和ECAR（D）。(E和F) 使用NT或Atxn2 ASO并过表达GFP(对照)或IDH1的GFP-或TDP-43过表达神经元的糖酵解ATP（E）和ECAR（F）。(G) IDH1过表达对TDP-43毒性的影响，以NeuN计数衡量。数据以GFP对照进行归一化。(H) 线粒体功能障碍时还原性谷氨酰胺羧化的简化示意图。该途径中涉及的酶以及在Atxn2 ASO处理后在小鼠脑中上调的酶以粗体标注。

所有数据均为均值±标准误；统计显著性通过单因素方差分析结合Tukey多重比较检验（A、C和E）或双因素方差分析后接?idák多重比较检验（G）评估，其中*p校正后<0.05，**p校正后<0.01，***p校正后<0.001，****p校正后<0.0001。

**Ataxin-2缺失在体外增强星形胶质细胞的胆固醇产生**

鉴于我们的蛋白质组学结果和TDP-43调节胆固醇合成的已知作用，我们假设星形胶质细胞保护机制至少部分通过增加胆固醇合成介导。首先，我们验证了质谱数据在体外的可重复性。在神经元-星形胶质细胞共培养实验中进行western blot证实，当神经元过表达TDP-43时HMGCS1减少，而ataxin-2敲低后HMGCS1水平部分恢复（图4A和4B）。接下来，我们用表达HMGCS1的慢病毒转导星形胶质细胞，然后使用这些星形胶质细胞进行共培养和神经元存活测定（图4C和4D；图S8A）。在星形胶质细胞中过表达HMGCS1对TDP-43对神经元的毒性具有保护作用。为进一步验证ataxin-2敲低在体外通过该途径发挥保护作用，我们将Atxn2 ASO处理与靶向Hmgcs1的小干扰RNA(siRNA)结合使用（图S8B；图4E和4F）。证实我们的假设，共培养中HMGCS1的敲低消除了ataxin-2敲低在星形胶质细胞中给予的保护作用。为排除胆固醇生物合成在神经元中的可能贡献，我们在初级神经元培养中过表达了HMGCS1；我们未观察到任何存活率挽救（图S8C和S8D），这为ataxin-2通过星形胶质细胞中胆固醇合成发挥非细胞自主性效应提供了额外证据。最后，通过下调Abca1——一种关键的胆固醇外排转运蛋白——来阻断胆固醇释放，消除了Atxn2 ASO的促存活效应（图4G和4H）。总之，这些数据表明HMGCS1及其下游效应因子ABCA1是支持该共培养模型中神经元活力的星形胶质细胞来源胆固醇途径所必需且充分的（图4I）。该非细胞自主性机制与上述描述的神经元自主性IDH1依赖性途径并行发挥作用（图3），表明Atxn2下调启动了至少两个不同但收敛的神经保护机制，而非单一统一途径。

图4 星形胶质细胞中ataxin-2耗竭增强胆固醇生物合成，支持神经元存活

(A) 使用NT或Atxn2 ASO处理的对照GFP-或TDP-43过表达神经元共培养的星形胶质细胞中HMGCS1蛋白水平的western blot分析。定量显示信号强度相对于GAPDH，以GFP + NT ASO条件进行归一化。(B) (A)中分析蛋白的代表性裁剪western blot条带。(C) 过表达HMGCS1或BFP对照的星形胶质细胞上培养的TDP-43或GFP表达神经元的NeuN阳性细胞计数。数据以BFP对照条件进行归一化。(D) 过表达TDP-43并接种在过表达HMGCS1的星形胶质细胞上的初级神经元经NeuN染色后的代表性图像（比例尺，200 μm）。(E) 经过Atxn2 ASO和Hmgcs1 siRNA处理后的TDP-43过表达或GFP表达神经元与星形胶质细胞共培养体系的NeuN阳性细胞计数。数据以GFP + NT ASO + scrambled(Scr) siRNA条件进行归一化。(F) (E)中定量的Hmgcs1 siRNA实验共培养体系中NeuN染色的代表性图像（比例尺，200 μm）。(G) 经过Atxn2 ASO和Abca1 siRNA处理后的TDP-43过表达或GFP表达神经元与星形胶质细胞共培养体系的NeuN阳性细胞计数。数据以GFP + NT ASO + scrambled(Scr) siRNA条件进行归一化。(H) (G)中定量的Abca1 siRNA实验共培养体系中NeuN染色的代表性图像（比例尺，200 μm）。(I) 胆固醇生物合成的甲羟戊酸途径简化示意图。HMGCS1是在蛋白质组学分析中ataxin-2敲低后上调的关键酶，催化该途径的第一个反应。紫色箭头表示ataxin-2下调对HMGCS1表达以及胆固醇生物合成下游效应的影响。

所有数据均为均值±标准误；统计显著性通过单因素方差分析后接Tukey多重比较检验(A)或双因素方差分析后接?idák多重比较检验（C–G）评估，其中*p校正后<0.05，**p校正后<0.01，***p校正后<0.001，****p校正后<0.0001；以及双因素方差分析后接Fisher最小显著差异(LSD)多重比较检验（E），其中*p<0.05，**p<0.01。

**讨论**

本研究确定了pbp1/ataxin-2下调在进化上相距甚远的系统中对抗TDP-43毒性的代谢中心框架。pbp1/ataxin-2减少并非简单地逆转TDP-43引起的分子扰动，而是启动适应性代谢反应，使细胞在应激下能够维持能量产生和营养支持。在酵母和神经细胞中，pbp1/ataxin-2减少使能量产生从受损的线粒体转向替代途径。在酵母中，pbp1缺失激活过氧化物酶体脂肪酸氧化；而在神经元中，Atxn2沉默激活糖酵解和还原性谷氨酰胺羧化。此外，在星形胶质细胞中，Atxn2沉默增强胆固醇生物合成，提供营养支持，以非细胞自主性方式增强神经元存活。总之，这些数据确定了ataxin-2作为暴露于TDP-43毒性的细胞中应激适应性代谢可塑性的调节因子。TDP-43扰动的途径与ataxin-2缺失激活的途径之间的差异（在酵母和小鼠中均有观察到）表明，ataxin-2减少并非仅仅纠正TDP-43诱导的分子缺陷，而是将细胞状态重新编程为应激韧性状态。此前，ataxin-2中的polyQ扩展已被发现与TDP-43的异常隔离有关，从而干扰轴突mRNA的空间定位和局部翻译。此外，先前的研究表明ataxin-2在RNP颗粒形成中充当关键介质，并强调通过突变其特定结构域来靶向减少ataxin-2介导的RNP颗粒形成可以减轻FUS和C9orf72 ALS模型中的神经退化。这些发现可能提示ataxin-2减少改变了应激颗粒的形成或内容物，释放编码糖酵解、还原性羧化和胆固醇生物合成酶的mRNA以供翻译，尽管这一机制仍有待测试。

从酵母中的过氧化物酶体补偿到哺乳动物中的糖酵解/还原性通量和固醇途径，这种跨物种一致性表明ataxin-2的代谢调节在系统发育上保守且在应激下具有功能相关性。

能量衰竭和脂质失调日益被认为是ALS的共同特征。我们的体外数据显示，Atxn2沉默通过糖酵解/还原性谷氨酰胺羧化恢复ATP，并增加来自星形胶质细胞的胆固醇供应，将ataxin-2与ALS中两个反复出现的易损性联系起来：神经元生物能学和胶质细胞介导的代谢支持。PET和放射自显影研究显示，脑葡萄糖低代谢可在细胞死亡前检测到，并随疾病进展而变化。此外，最近的研究直接将TDP-43错误定位与己糖激酶1介导的糖酵解受损联系起来，使糖酵解恢复成为ALS的潜在治疗策略。Ataxin-2下调可能直接缓解这种葡萄糖低代谢，纠正ALS中的能量危机，并为退化的运动神经元提供韧性。

我们的体外研究突显了IDH1作为实现这一目的的潜在药理学靶点，提出了IDH1导向策略可能作为一种互补或替代治疗途径的可能性——在相关中枢神经系统区域难以将ataxin-2降低至足够阈值的情况下尤为如此。一个重要的悬而未决的问题是：ataxin-2的下调如何影响TDP-43的剪接特征。在本研究使用的TAR4/4模型中，我们未能检测到胞质TDP-43聚集、核TDP-43清除或暗箱外显子包含，尽管已有研究小组在此品系中报告了这些特征。然而，我们能够检测到TAR4/4小鼠中的TDP-43诱导的外显子跳跃，这与近期报告一致，即TDP-43过表达本身即足以导致这种剪接缺陷，独立于错误定位。值得注意的是，Atxn2 ASO治疗并未改变这种外显子跳跃的程度（未发表数据）。这表明ataxin-2的神经保护效应在机制上独立于TDP-43驱动的剪接缺陷。该发现与我们的核心结论一致并进一步支持之，即ataxin-2的下调主要通过适应性代谢重编程发挥作用，而非通过纠正TDP-43诱导的分子病理。TDP-43通过抑制SREBP2活性和下调其靶标（包括HMGCS1）来损害胆固醇合成。我们的功能缺失和获得实验表明，HMGCS1与ABCA1介导的胆固醇外排共同构成了这一星形胶质细胞保护途径所必需且充分的要素，该途径与神经元内源性IDH1依赖性机制并行作用，而非取代后者。虽然患者数据显示胆固醇水平较高与发病风险增加相关，但诊断后较高的胆固醇水平与较低的死亡率相关，这表明诊断后上调星形胶质细胞胆固醇转运可能有助于支持受损神经元。值得注意的是，在野生型小鼠中，降低ataxin-2水平仅导致少量蛋白质表达变化，且此处确定的神经保护通路未被上调，提示了良好的安全性特征——干预将影响应激细胞，而健康细胞基本不受影响。ataxin-2如何感知病变神经元中的应激尚不清楚。代谢失衡、能量危机或活性氧（ROS）升高等应激相关信号可能被ataxin-2感知，这定义了一个未来研究的有前景的领域。我们的蛋白质组学研究是在凋亡前期脑区进行的，因此捕捉到了延长神经元存活的保护性反应。我们的体外研究表明，操纵ataxin-2水平可以延长神经元在TDP-43过表达和TDP-43下调两种情况下的寿命，显著拓展了对ALS的相关性。我们的结果还提名了下游靶点IDH1和HMGCS1，它们可以补充或替代ataxin-2降低。在神经元中，增强IDH1依赖的还原性谷氨酰胺羧化或稳定胞质NADPH/NADH穿梭可以在呼吸应激下保存ATP。在星形胶质细胞中，增强胆固醇生物合成和导出可以支持退化环路中的突触和膜维护。如果单纯抑制ataxin-2不足够或无法在相关细胞类型中均匀实现，这些策略可能尤其有价值。更广泛地说，我们的发现鼓励转向"代谢韧性"治疗策略，同时应对神经元生物能量衰竭和胶质营养缺陷。近期一项ATXN2 ASO的早期临床试验报告了脊髓液中ataxin-2水平的温和降低，在观察窗口内未显示临床获益（临床试验NCT04494256；Ravits J, 欧洲肌萎缩侧索硬化症治愈网络，2024年6月19日第20届会议）。在我们的实验中，我们实现了超过90%的ataxin-2下调。这提出了一个重要的区分，我们认为在解读试验结果时未被充分解决：临床获益的缺失可能反映ataxin-2降低在患者中确实缺乏神经保护，也可能是技术层面未能在相关中枢神经系统区域（即运动皮层和脊髓）实现足够的靶标参与。脊髓液与中枢神经系统组织中ataxin-2蛋白质水平之间的关系据我们所知尚未有报道。没有这些信息，以及试验药效学数据的完整同行评审报告，无法确定该试验是否充分检验了基础生物学假设。因此，我们谨慎对待将该试验解读为反对ataxin-2作为治疗靶点的证据。这一审慎态度得到两条证据线索的加强：ATXN2中中等长度聚谷氨酰胺扩展仍然是ALS中最稳健复制的常见遗传风险因素之一；包括我们研究在内的前临床研究显示了ataxin-2沉默的强神经保护效应。我们的结果表明，治疗疗效可能需要实现ataxin-2降低的强阈值，在神经元中足以激活还原性谷氨酰胺羧化和糖酵解，在周围星形胶质细胞中足以增强胆固醇生物合成。重要的是，理解神经保护机制可能有助于选择生物标志物以了解未来试验中的靶标参与情况。总之，ataxin-2的下调激活了跨越神经元和星形胶质细胞的适应性代谢程序，保护细胞免受TDP-43诱导的应激。我们的发现表明，通过使神经元能够独立于受损线粒体产生ATP并增加星形胶质细胞胆固醇支持，靶向ataxin-2可能解决ALS中的两个核心且收敛的弱点。这些见解为完善ataxin-2导向疗法、开发互补代谢干预以及部署一致生物标志物以指导和降低临床转化风险提供了机制依据。研究局限性特定代谢通路对体内生存获益的因果贡献尚未直接测试。我们体外对IDH1和HMGCS1/ABCA1的操纵支持这些通路在ataxin-2介导的神经保护中发挥作用的证据，但它们是否单独必要或充分以实现TAR4/4小鼠中观察到的生存获益仍有待确定。另一局限性是，我们的功能剖析仅在基于TDP-43的模型中进行。由于TDP-43功能障碍是大多数ALS病例（包括C9orf72和散发性ALS）的共同特征，我们预期这些代谢脆弱性可能超越TDP-43驱动的疾病。然而，我们尚未测试ataxin-2下调是否在SOD1或FUS-based模型中激活相同通路，或其他家族性（例如C9orf72-based模型）或散发性ALS中如此。一个相关的考虑是，在整个工作中我们降低了野生型pbp1/Atxn2的水平，并未直接测试多Q扩展的、与ALS相关的ATXN2等位基因。ATXN2中中等CAG重复扩展是公认的ALS遗传风险因素，但其功能后果尚未完全理解，扩展的ATXN2可能至少部分通过新显性机制发挥作用。因此，我们的分析涉及野生型ataxin-2的应激适应性作用，并未确立多Q扩展ATXN2是否激活相同的代谢程序。我们将这些程序提出为ATXN2降低策略激活的候选通路——该策略降低总ATXN2蛋白而不考虑重复长度——而非作为多Q扩展ATXN2在ALS中主要致病机制的解释。资源可用性通讯联系人请求进一步信息和资源应联系通讯联系人Ana Jovi?i?（[e-mail]），将由其满足。材料可用性本研究中生成的DNA质粒可按请求提供。数据和代码可用性•蛋白质组学数据集文件和定量结果已存入MassIVE仓库（MSV000099989），自发表之日起公开可用。•本文未报告原始代码。致谢我们感谢Casper Hoogenraad、Alessandro Ori、Baris Bingol和Brad Friedman提供的宝贵科学意见及对稿件的批判性阅读。本研究由Genentech公司提供支持。作者贡献D.G.和A.J.共同设计实验。D.G.、H.H.B.、S.V.、Y.Z.和V.P.进行数据收集和分析。A.J.、O.F.和M.C.监督数据获取、分析和结果解读。D.G.和A.J.撰写稿件，所有作者均对稿件提供反馈。A.J.监督并构思了项目。利益声明S.V.、H.H.B.、O.F.、Z.Y.、V.P.、Y.Z.、M.C.和A.J.是Genentech公司的全职雇员。研究期间，D.G.为Genentech公司全职雇员。生成式AI和AI辅助技术在稿件准备过程中的声明在准备本作品过程中，作者使用Claude（Anthropic）改进语言。作者对输出进行了审查和编辑，并对已发表文章的内容承担全部责任。STAR★方法关键资源表试剂或资源 | 来源 | 标识符 抗体：抗NeuN（Millipore MAB377; RRID:AB_2298772）、抗NeuN（Millipore ABN78; RRID:AB_10807945）、Alexa抗兔647（Invitrogen A21207）、抗HMGCS1（ProteinTech 17643-1-AP; RRID:AB_2248359）、抗GAPDH（Sigma-Aldrich G8795; RRID:AB_1078991）、IRDye二抗（LICORbio N/A） 化学试剂、肽和重组蛋白：木瓜蛋白酶解离系统（Worthington MSPP-LK003150）、Neurobasal（Gibco 21103049）、B27补充剂（Gibco 17504044）、青霉素/链霉素（Gibco 15070063）、GlutaMAX（Gibco 35050061）、马血清（Gibco 26050-088）、HBSS（Gibco 4175095）、多聚甲醛（PFA）（Electron Microscopy Services 15710）、牛血清白蛋白（BSA）（EMD Millipore 126609）、Intercept TBS封闭缓冲液（LICORbio 927-60001）、Intercept T20 TBS抗体稀释液（LICORbio 927-75001）、Seahorse XF DMEM培养基pH 7.4（Agilent Technologies 103575-100）、Seahorse XF葡萄糖（Agilent Technologies 103577-100）、Seahorse XF丙酮酸（Agilent Technologies 103578-100）、Seahorse XF谷氨酰胺（Agilent Technologies 103579-100）、Hoechst 33342（BD Pharmingen 561908） 关键商业检测：RNAeasy Plus Mini Kit（QIAGEN 74134）、TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit（Applied Biosystems 4392938）、Seahorse ATP速率检测试剂盒（Agilent technologies 103592-100） 实验模型：生物体/品系：小鼠TAR4/4（B6;SJL-Tg(Thy1-TARDBP)4Singh/J Jackson 012836）、小鼠野生型B6SJLF1/J（Jackson 100012）、小鼠野生型C57BL6/N（Charles River 027） 寡核苷酸：Ataxin-2（Thermo Fisher Scientific Mm00485946_m1）、Hmgcs1（Thermo Fisher Scientific Mm01304569_m1）、Cth（Thermo Fisher Scientific Mm00461247_m1）、Gapdh（Thermo Fisher Scientific Mm99999915_g1）、Idh（Thermo Fisher Scientific Mm00516030_m1）、Hprt1（Thermo Fisher Scientific Mm03024075_m1）、Accell Smart Pool Mouse Idh1/Abca1/Hmgcs1（Horizon Discovery N/A）、shTARDBP GTAGATGTCTTCATTCCCAAA（Sigma N/A）、对照shRNA CAACAAGATGAAGAGCACC（AA）（Sigma N/A） 重组DNA：pLV[Exp]-mPGK>NLS-EGFP（Vector Builder N/A）、pLV[Exp]-mPGK>hTARDBP[NM_007375.3]/3xGGGGS/EGFP（Vector Builder N/A）、pLV[Exp]-mPGK>TagBFP2（Vector Builder N/A）、pLV[Exp]-TagBFP2-mPGK>mHmgcs1[NM_001291439.1]（Vector Builder N/A）、Idh1-Myc-DDK NM_010497（Origene MR217871L3V）、对照Vector-Myc-DDK（Origene PS100092V） 软件和算法：MATLAB（Mathworks, Natick, MA N/A）、Incucyte?基础分析软件（Sartorius N/A）、Empiria Studio 2.1（LICORbio N/A）、QuantStudio? 7 Flex（Applied Biosystems N/A）、Seahorse Wave Controller Software 2.6（Agilent technologies N/A）、DAVID 6.8（Bioinformatic Resources N/A）、R包MSstats TMT v2.4.1（R Project for Statistical Computing N/A）、DIA-NN v1.8.1（DIA-NN Analysis N/A）、Ingenuity Pathway Analysis（QIAGEN N/A） 存档数据：质谱（本文MSV000099989） 实验模型 酵母菌株、培养基和质粒：酵母细胞在富集培养基（YPD）或缺尿嘧啶含2%葡萄糖（SD-Ura）或半乳糖（Sgal-Ura）的合成培养基中生长。TDP-43和GFP酵母表达质粒由VectorBuilder Inc.（美国伊利诺伊州芝加哥）制备，将TARDBP或GFP编码序列插入含GAL启动子的YEp质粒中。所有构建体均经DNA测序验证。YEp-GAP-TDP43或YEp-GAL-GFP构建体转化至BY4741菌株。菌株操纵和培养基制备采用标准技术。我们使用PEG/醋酸锂方法将质粒DNA转化酵母。为蛋白质组学实验诱导TDP-43或GFP表达，酵母细胞在30°C液态Sglu-Ura培养基中过夜生长至对数或中对数期。然后将培养物稀释至OD600 0.5，在30°C的Sgal-Ura培养基中生长8小时。 小鼠品系：TAR4/4小鼠购自JAX（货号：012836，B6;SJL-Tg(Thy1-TARDBP)4Singh/J）。TDP-43Tg/+小鼠通过与JAX来源的F1杂交小鼠交配在B6/SJL杂交背景上维持以繁殖该品系（货号：100012，B6SJLF1/J）。小鼠在常规光/暗周期（14:10小时）下饲养，自由摄食（LabDiet 5010）和饮水。所有操作在光相进行。所有小鼠实验方案均经机构动物护理和使用委员会批准，并遵照NIH《实验室动物护理和使用指南》执行。本研究使用动物的伦理批准编号为TH23-1689。 方法细节 脑室内注射（ICV）：出生后第1天幼鼠被转移到湿冰上的纸巾上，进行约5-8分钟的低温麻醉。通过轻捏后爪并观察是否有运动反应来确认麻醉。使用10μl Neuros Hamilton注射器（货号#7635-01）配针头（32号，尖端样式4，0.75英寸长度，30°斜面）进行脑室注射，注射点位于lambda与幼鼠眼部之间直距的2/5处。针头垂直于颅骨表面插入，Hamilton针头斜面朝向中线。到位后缓慢注射3μl注射液（15μg/mL），注射后保持针头原位10秒以防止回流，然后缓慢拔出。幼鼠随后立即放置于加热垫上直至恢复正常肤色并开始活动。 表型评分和人道安乐死终点确定：所有表型评分在盲法下完成，即评分者不知晓动物的基因型或处理组，每天测试动物的顺序随机。步态损伤评分如前所述：0分为正常行走；1分为行走时有震颤或跛行；2分为严重震颤、严重跛行、骨盆下降或运动时脚部偏离身体；3分为行走困难，关节运动极少，脚部不产生前行动力，难以保持直立，或腹部拖地；4分为安乐死终点，即小鼠在3次试验中的全部3次均无法在15秒内翻身。

为动物福利着想，在生存分析中采用了人道安乐死终点而非自然死亡，但这也提供了一个更精确的终点，该终点直接依赖于运动功能障碍（与ALS相关的表型），而较少依赖于食物和水分摄入不足。为组织采集，所有动物均在19至32日龄之间进行安乐死。

**用于免疫组织化学的组织采集**

小鼠使用2.5%三溴乙醇（0.5 mL/25 g体重）安乐死，先用磷酸盐缓冲液（PBS）经心脏灌注放血，随后灌注4%多聚甲醛（PFA）固定。脑组织经解剖后在4% PFA中后固定过夜，然后转入PBS中，送至美国田纳西州诺克斯维尔的NeuroScience Associates进行切片和组织学处理。

**小鼠组织的免疫组织化学**

脑组织用20%甘油和2%二甲基亚砜处理过夜以防止冻切伪影，并使用MultiBrain?技术（美国田纳西州诺克斯维尔NeuroScience Associates）多重包埋至明胶基质中。每个MultiBrain块沿冠状面以30 μm厚度切片。在整个半脑中每隔300 μm等间距取33张连续切片用于染色。IHC染色使用抗NeuN抗体（Millipore，产品号 MAB377），并用氨基氯化银（de Olmos变性细胞染色）进行复染。

脑部全玻片扫描在200倍放大下使用NanoZoomer系统（日本滨松公司，美国加州圣何塞）完成。每只小鼠分析10至12张图片，使用MATLAB（Mathworks，美国马萨诸塞州纳蒂克）进行分析。在MATLAB中通过颜色阈值和形态学运算检测组织切片、神经元和变性染色。图像分析过程中对实验分组和基因型进行盲法操作。对于脑组织，每个区域定量4至5张切片，前脑（FB）定量切片位于（bregma ?1.22mm至?2.18）坐标之间，后脑（HB）定量切片位于（bregma ?5.52mm至?6.48）坐标之间，参照Allen脑图谱。对于脊髓，每只动物/每种染色定量腰段L3-L5区域的10张切片。

**原代培养**

**小鼠原代皮层神经元制备**

从小鼠C57BL6/N（Charles River）E15.5胚胎中制备小鼠原代皮层神经元，使用Papain分离系统（MSPP-LK003150，Worthington），按制造商说明进行操作。原代神经元接种于含以下成分的铺板培养基中：Neurobasal（Gibco 21103049）、1× B27补充剂（Gibco 17504044）、1×青霉素/链霉素（Gibco 15070063）、1× GlutaMAX?补充剂（Gibco 35050061）和10%马血清（Gibco 26050-088），孵育18小时。随后更换为维持培养基，其成分与铺板培养基相同但不含马血清。每7天进行半量换液。

**小鼠原代星形胶质细胞制备**

从小鼠C57BL6/N幼鼠（Charles River）出生第2至第3天（P2-P3）制备小鼠原代星形胶质细胞。皮层经解剖、HBSS（Gibco 14175095）冲洗后，在完全培养基DMEM（自制）中进行破碎。破碎后细胞接种于T75培养瓶中，在含25% FBS的完全DMEM培养基中维持7天。随后更换为含10% FBS的完全DMEM培养基。培养10天后，将细胞在37°C、220 rpm条件下摇床振荡过夜以去除小胶质细胞和少突胶质细胞，随后用胰酶消化并重新接种于含10% FBS的完全DMEM培养基中。

**共培养制备**

对于星形胶质细胞-原代神经元共培养，星形胶质细胞经胰酶消化后以每孔50000个细胞的密度重新接种于96孔板中，在DMEM 10% FBS培养基中培养。一周后，培养基更换为神经元维持培养基，并在星形胶质细胞上接种30000个原代神经元。每2天进行半量换液。

**原代神经元、星形胶质细胞和共培养的处理**

**反义寡核苷酸（ASO）**

在本文所述实验中使用了一种Atxn2反义寡核苷酸序列和一种对照非靶向（NT）ASO序列，并在内部合成。在原代神经元和共培养中，ASO处理通过gymnosis转染方式以10 μM浓度给药，对于TDP-43过表达毒性研究，在原代神经元铺板后第2天开始；对于功能丧失毒性研究，在铺板后第5天开始。

**siRNA**

Horizon Accell Smart Pool小鼠Idh1、Abca1和Hmgcs1 siRNA通过gymnosis转染方式以1 μM浓度给药。原代神经元中siRNA处理在铺板后第2天开始。共培养中，siRNA转染在神经元铺板后第5天开始。

**慢病毒转导**

在原代神经元中过表达NLS-GFP或hTDP-43-GFP载体是通过慢病毒转导实现的，使用以下构建体（Vector Builder），感染复数（MOI）= 5：pLV[Exp]-mPGK>NLS-EGFP和pLV[Exp]-mPGK>hTARDBP[NM_007375.3]/3xGGGGS/EGFP。原代神经元在DIV5时进行转导。如需双慢病毒表达，则NLS-GFP或hTDP-43-GFP载体的过表达推迟至DIV7进行。

在原代星形胶质细胞中过表达BFP-HMGCS1或BFP载体是通过慢病毒转导实现的，使用以下构建体（Vector Builder），感染复数（MOI）= 5：pLV[Exp]-mPGK>TagBFP2和pLV[Exp]-TagBFP2-mPGK>mHmgcs1[NM_001291439.1]。原代星形胶质细胞在重新接种后第2天进行转导。

Idh1-Myc-DDK（NM_010497，Origene MR217871L3V）或对照载体（Origene PS100092V）的过表达是通过在原代神经元铺板后第5天以感染复数（MOI）= 5进行慢病毒转导实现的。

在原代神经元中实现TDP-43功能丧失是通过慢病毒转导以下载体实现的：pLKO.1-CMV-tGFP，包含针对TDP-43的序列GTAGATGTCTTCATTCCCAAA；以及shRNA对照载体pLKO.1-puro，包含非靶向序列CAACAAGATGAAGAGCACCAA。慢病毒转导以感染复数（MOI）= 5在铺板后第7天进行。

**NeuN计数的免疫荧光**

用于TDP-43过表达毒性的原代神经元和原代共培养在慢病毒转导后第8天固定，用于TDP-43功能丧失研究的则在慢病毒转导后第7天固定，依据细胞死亡发生时间而定。两种情况下，细胞均在室温（RT）下用4%多聚甲醛（PFA，Electron Microscopy Services #15710）固定20分钟，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次。随后细胞在PBS中稀释的3%牛血清白蛋白（BSA，EMD Millipore 126609）中封阻30分钟（RT）。然后细胞在PBS中0.2% Triton X-100中通透10分钟，PBS洗涤一次，再次在3% BSA-PBS中孵育15分钟。接着，抗NeuN一抗（EMD Millipore #ABN78）在4°C孵育过夜。次日，细胞用PBS洗涤3次，与二抗Alexa抗兔647（Invitrogen #A21207）在室温下孵育1小时。细胞用PBS洗涤3次后，使用Incucyte S3（Sartorius）在10倍或20倍放大下采集图像，并使用Incucyte? Base Analysis Software（Sartorius）利用红色物体计数功能进行分析。统计分析中，每次实验中的每个数据点代表每个复孔4张图片的平均值。

**Western Blot分析**

小鼠原代共培养在慢病毒转导后第8天直接用含0.1M DTT的NuPAGE? LDS样品缓冲液在冰上裂解。样品在95°C煮沸5分钟，取20 μl样品在NuPAGE? Bis-Tris Mini蛋白凝胶（Invitrogen）4–12%上电泳，随后使用iBlot? Transfer Stack PVDF膜通过iBlot 2 Western Blot转印系统（程序P0）进行转膜。膜用Intercept（TBS）封闭缓冲液（LICORbio #927-60001）在室温下封闭30分钟，然后用稀释于Intercept T20（TBS）抗体稀释液（LICORbio #927-75001）中的一抗在4°C孵育过夜。经3次TBST 0.1% Tween 20洗涤后，用IRDye?二抗（LICORbio）在室温下孵育1小时。膜再次用TBST 0.1% Tween 20洗涤3次，然后用Odyssey? DLx（LICORbio）采集信号，并使用Empiria Studio 2.1软件（LICORbio）进行分析。

蛋白质 | 公司 | 目录号 | 种属 | 稀释比例
---|---|---|---|---
HMGCS1 | ProteinTech | 17643-1-AP | 兔 | 1:1000
GAPDH | Sigma-Aldrich | G8795 | 小鼠 | 1:10000
**一抗**

**RT-qPCR**

使用RNeasy Plus Mini Kit（QIAGEN #74134）按制造商说明从小鼠原代细胞（慢病毒转导后第8天）和小鼠脑组织中提取RNA。RNA定量使用Nanodrop 8000（Thermo Fisher Scientific）完成。随后使用TaqMan? RNA-to-CT? 1-Step Kit（Applied Biosystems #4392938）按制造商说明，以100 ng RNA进行RT-qPCR。RT-qPCR在QuantStudio? 7 Flex仪器（Applied Biosystems）上进行。分析采用delta-delta Ct方法，以管家基因Gapdh进行归一化。使用的TaqMan基因表达检测探针（Thermo Fisher Scientific）如下：Ataxin-2（Mm00485946_m1）、Hmgcs1（Mm01304569_m1）、Cth（Mm00461247_m1）、Gapdh（Mm99999915_g1）、Idh1（Mm00516030_m1）、Hprt1（Mm03024075_m1）。

**Seahorse ATP速率测定**

本实验使用Seahorse ATP速率检测试剂盒（Agilent Technologies #103592-100），按制造商方案进行操作。实验前将原代神经元培养基更换为Seahorse XF DMEM培养基，pH 7.4（Agilent Technologies #103575-100），含10 mM XF葡萄糖（Agilent Technologies #103577-100）、1 mM XF丙酮酸（Agilent Technologies #103578-100）和2 mM XF谷氨酰胺（Agilent Technologies #103579-100）。细胞以每孔25000个细胞的密度接种。细胞在慢病毒转导后第8天进行分析。每次实验通过Hoechst 33342染色（BD Pharmingen #561908）计数细胞数进行归一化，使用Agilent BioTek Cytation 1（Agilent Technologies）完成。实验在Seahorse XFe96分析仪（Agilent Technologies）上进行，使用Seahorse Wave Controller Software 2.6（Agilent Technologies）进行分析，并通过软件提供的报告生成器导出数据。

**基于质谱的酵母蛋白质组学实验**

**酵母蛋白质组学样品制备**

酵母细胞经收集后在含9M尿素和磷酸酶抑制剂（1 mM正钒酸钠、2.5 mM焦磷酸钠和1.0 mM β-甘油磷酸）的HEPES缓冲液（20 mM，pH 8.0）中裂解。为进行全蛋白组分析，共制备4种实验条件下的裂解液，产生总共18个样品。条件包括：WT含GFP（n = 4）、WT含TDP-43（n = 5）、pbp1Δ含GFP（n = 4）和pbp1Δ含TDP-43（n = 5）。裂解液经超声处理后在15°C、20,000 g下离心20分钟。使用Bradford法（BioRad，CA州赫库勒斯）测定蛋白浓度。蛋白质在37°C下用5 mM二硫苏糖醇（DTT）还原1小时，然后在室温下用15 mM碘乙酰胺（IAA）在避光条件下烷基化20分钟。样品稀释至终浓度2M尿素，进行顺序酶解：先用Lys-C（Wako，日本）在37°C处理2小时，随后用胰蛋白酶（Promega，WI州麦迪逊）在37°C过夜处理，酶与底物（E:S）比为1:50。酶解混合物在使用C18固相萃取柱（Waters，MA州米尔福德）前用20%三氟乙酸（TFA）酸化。肽段用60%乙腈（ACN）/0.1% TFA洗脱，然后使用定量比色肽段测定试剂盒（Thermo，CA州圣何塞）测量肽段浓度。每种条件取等量样品（100 μg）过夜冻干。

干燥的肽段混合物用100 μL HEPES（100 mM，pH 8.5）复溶。向18个样品中分别加入TMTPro试剂，通道126-135N（20 μL，浓度为500 μg/50 μL ACN）。标记在室温下反应1小时。每种条件取少量（2 μL）混合、脱盐和检测以确定标记效率。确定标记效率至少达到95%后，加入5 μL 5%羟胺淬灭反应。样品混合后用20% TFA酸化并过夜冻干。18重TMT标记肽段混合物用C18固相萃取柱（Waters，MA州米尔福德）脱盐。肽段用60% ACN/0.1% TFA洗脱。样品过夜冻干后进行高pH反相分级，使用Agilent 1100 HPLC系统（Agilent Technologies，CA州圣克拉拉）。肽段混合物用75 μL溶剂A（5% ACN/50 mM碳酸铵，pH 8.0）复溶，在Zorbax 300Extend-C18柱（3.5 μm，4.6 × 150 mm，Agilent Technologies，CA州圣克拉拉）上分离，流速0.5 mL/min。在49分钟内施加从15%到45%溶剂B（90% ACN/50 mM碳酸铵，pH 8.0）的梯度，总运行时间75分钟。以0.63分钟间隔收集96个分级馏分，每25个馏分合并为一组，形成24组馏分。馏分用20% TFA酸化、干燥并用SDB柱（GL Sciences，CA州托伦斯）脱盐后，进行质谱分析。

**酵母的液相色谱-质谱（LC-MS）分析**

脱盐后的肽段用2% ACN/0.1%甲酸（FA）/水复溶，并通过Dionex Ultimate 3000 RSLC nano Proflow系统（Thermo Fisher）上样至Aurora Series 25 cm × 75 μm内径柱（IonOpticks）。肽段分离在300 nL/min流速下进行，采用两步线性梯度：溶剂B（0.1% FA/2%水/ACN）在70分钟内从4%升至30%，然后在4.9分钟内从30%升至75% B，总分析时间100分钟。肽段使用Orbitrap Eclipse仪器（Thermo Fisher Scientific，CA州圣何塞）进行分析。利用Xcalibur方法编辑器内置功能对酵母数据库进行实时搜索。采用了蛋白封闭（关闭）策略（每种蛋白每次运行3种不同肽段）。

前体离子 (MS1) 在轨道阱中进行分析（250% 归一化自动增益控制目标，120,000 质量分辨率，50 ms 最大注入时间），选择丰度最高的 15 个物种进行 MS2 碎裂。基于电荷状态≥2 (z 2–6) 和单同位素峰分配对离子进行过滤，并启用动态排除 (20 s ± 10 ppm)。每个前体离子的质量隔离宽度为 0.5 Th，随后使用碰撞诱导解离 (CID，30 NCE) 进行碎裂，归一化 AGC 目标为 150%，最大注入时间为 100 ms。使用同步前体选择 (SPS) 隔离多个碎片离子后进行 MS3 HCD 碎裂 (40 NCE，SPS notches = 8，600% 归一化 AGC 目标，最大注入时间 350 ms)。MS3 扫描在轨道阱中以 50,000 分辨率进行分析。原始数据文件已存入 MassIVE 数据库。

酵母 DDA-TMT 数据的数据分析
MS/MS 数据使用 Comet 搜索算法针对串联正反向靶标 - 诱饵数据库 (UniProtKB concat, 2021) 进行检索，该数据库包含酵母蛋白和常见污染物序列。使用 20 ppm 的前体质量容差分配光谱，低分辨率 MS/MS 的碎片离子设置中碎片离子 bin 容差为 1.0005，bin 偏移量为 0.4。静态修饰包括氨基甲酰甲基半胱氨酸 (+57.0215 Da) 以及肽段 N 端和赖氨酸残基上的 TMT 标签 (+304.2071 Da)。可变修饰包括氧化甲硫氨酸 (+15.994 Da) 和酪氨酸残基上的 TMT 标签 (+304.2071 Da)。指定胰蛋白酶特异性，允许最多 1 个错切。肽谱匹配在 1% 假发现率 (FDR) 下进行过滤。TMT 报告离子定量使用内部 Mojave 模块进行，通过计算理论报告质量窗口 20 ppm 内的最高峰并校正同位素纯度来执行。

使用 R 包 MSstatsTMT v.2.4.1 在统计分析之前预处理 PSM 级别定量，进行蛋白定量和差异丰度分析。MSstatsTMT 通过线性混合效应模型估算每个蛋白的 log2(倍数变化) 和标准误。推断过程通过应用经验贝叶斯收缩进行调整。为了检验丰度无变化的双侧零假设，将基于模型的检验统计量与适用于每个蛋白和数据集自由度的 Student t 检验分布进行比较。得到的 p 值使用 Benjamini–Hochberg 方法进行调整以控制 FDR。使用 DAVID 6.8 (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) 生物信息学资源对酵母失调蛋白进行基因本体 (GO) 富集分析。蛋白质类别基于 DAVID GO 分析的功能注释聚类结果分配。

小鼠大脑基于质谱的蛋白质组学实验
皮层第 5 层组织的激光捕获显微切割 (LCM)
聚丙烯微孔芯片 (孔径 2.2 mm) 由 Protolabs (Maple Plain, MN) 在聚丙烯基板上制造，用于样本收集和蛋白质组学制备。LC-MS 级水、异丙醇、甲酸 (FA)、氯乙酰胺 (CAA)、三 (2-羧乙基) 磷酸氢 (TCEP-HCl) 和乙腈购自 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)。N-十二烷基 β-D-麦芽糖苷 (DDM)、二甲基亚砜 (DMSO, HPLC 级)、氯化钠 (NaCl) 和碳酸氢铵 (ABC) 购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。胰蛋白酶购自 Promega (Madison, WI)。

组织解剖和收集使用 PALM MicroBeam 系统 (Carl Zeiss MicroImaging, Munich, Germany) 进行，该系统配备用于高精度激光微操作的 RoboStage 和用于转移解剖样本的 RoboMover。该系统能够直接将样本准确收集到 microPOTS 芯片的微孔中。激光解剖之前，每个微孔预加载了 1.5 μL 50% DMSO 水性缓冲液，含有 100 mM NaCl 和 100 mM ABC。皮层第 5 层组织根据冠状切片中的解剖位置和细胞结构进行注释、解剖和收集。组织样本收集到 microPOTS 芯片上对应的微孔中，每个孔作为一个生物学重复（一只动物）。

样本收集后，微孔芯片在 60°C 下孵育以蒸发 DMSO。随后，使用 HP D100 纳升级液体分配器将 2 μL 细胞裂解和蛋白提取缓冲液 (2 mM TCEP, 5 mM CAA，100 ABC 缓冲液中含 0.1% DDM) 分配到每个孔中。芯片在 60°C 下孵育 30 分钟以促进蛋白还原和烷基化。然后通过向每个孔中加入 0.5 μL 胰蛋白酶溶液 (100 mM ABC 中 80 ng/μL) 进行酶消化，随后在 37°C 下孵育 10 小时。消化后，使用 Evotip Pure 根据制造商方案清洁肽段。脱盐后的肽段收集到 96 孔微孔板中，用 speed vac 干燥，并悬浮于水中含有 0.1% FA 的 5μL 缓冲液中。

小鼠大脑的 LC-MS 分析
肽段分离使用 Ultimate 3000 RSLCnano 系统 (Thermo Fisher Scientific) 进行。孔中的肽段完全注入 20 μL 环路，并使用水中 0.1% FA 以 3 μL/min 的流速加载到 2 cm 长的捕集柱 (75 μm i.d., 3 μm 粒径，100 ? 孔径，C18) 上，持续 5 分钟。然后样品转移到维持在 50°C 的 IonOpticks Aurora Elite 分析柱 (250 mm × 75 μm, 1.7 μm 粒径) 上。分离梯度如下：3–20% 缓冲液 B (含 0.1% FA 的乙腈) 持续 100 分钟，20–35% 缓冲液 B 持续 10 分钟，35–90% 缓冲液 B 持续 1 分钟，并在 90% 缓冲液 B 下保持 7 分钟。

肽段通过电喷雾电离 (ESI) 电离，并使用连接 FAIMS Pro 接口的 Orbitrap Eclipse 质谱仪 (Thermo Fisher Scientific) 进行分析。离子源工作电压 1600 V，离子传输管加热至 300°C，S-Lens 射频水平设置为 30。FAIMS 补偿电压设置为?50 V。进行了数据非依赖采集 (DIA)。DIA 方法包括在轨道阱分析仪中进行 MS1 前体采集，扫描范围从 400 到 900 m/z。MS2 碎片采集也使用轨道阱分析仪进行，扫描范围设置为自动，默认电荷设置为 2。MS1 光谱在 120K 分辨率下采集，归一化 AGC 目标为 250%，最大注入时间为 246 ms。前体在 32% 的 HCD 碰撞能量下碎裂。隔离窗口设置为 20 m/z，最大离子注入时间设置为 54 ms，归一化 AGC 目标设置为 3000%。MS2 碎片光谱在 30K 分辨率下采集。原始数据文件已存入 MassIVE 数据库。

小鼠大脑 DIA 数据的分析
使用小鼠 (Mus musculus) 的 Swiss-Prot 蛋白质序列数据库 (下载日期 2024 年 4 月 17 日；17,214 个已审阅蛋白序列) 进行数据库检索。
DIA-NN 分析：使用 DIA-NN (v1.8.1) 采用默认参数进行无文库数据库检索。指定 Trypsin/P 为消化酶，允许一次漏切。修饰包括 N 端甲硫氨酸切除和半胱氨酸氨基甲酰甲基化。肽段长度限制为 7–30 个氨基酸。应用了 1% 的前体假发现率 (FDR)。其他设置包括"--report-lib-info"以及激活"FASTA digest for library-free search/library generation"和"Deep learning-based spectra, RTs, and IMs prediction"选项。启用运行间匹配 (MBR) 以提高肽段鉴定。

使用 DIA-NN (v1.8.1) 采用默认参数进行无文库数据库检索。小鼠 Swiss-Prot 蛋白质序列数据库 (下载日期 2024 年 4 月 17 日；17,214 个已审阅蛋白序列) 作为数据库检索的参考。指定 Trypsin/P 为消化酶，允许一次漏切。修饰包括 N 端甲硫氨酸切除和半胱氨酸氨基甲酰甲基化。肽段长度限制为 7–30 个氨基酸。应用了 1% 的前体假发现率 (FDR)。其他设置包括"--report-lib-info"选项以及激活"FASTA digest for library-free search/library generation"和"Deep learning-based spectra, RTs, and IMs prediction"选项。启用运行间匹配 (MBR) 以增强肽段鉴定。使用 MS1 定量进行统计分析。基于以下标准应用过滤：Lib.PG.Q.value <0.01, Lib.Q.value <0.01, PG.Q.value <0.01 和 Q.value <0.01。在全部 30 次运行中缺失值超过 40% 的前体离子被系统排除出分析。后续处理涉及等权中值归一化、缺失前体离子填补和蛋白汇总，均使用 MSstats v4.12.0 进行。使用线性模型进行统计分析，使用 R stats 包中的 lm 函数，将'Group'和'mice'重复纳入变量。使用 emmeans 包确定成对比较以及估算的 log2(倍数变化) 和标准误。为了检验丰度无变化的双侧零假设，将基于模型的检验统计量与 Student's t 检验分布进行比较，应用适用于每个蛋白和数据集的自由度。使用 Benjamini-Hochberg 方法调整得到的 p 值以控制 FDR。

通路分析从 QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis 库中识别出对数据集最显著的规范通路。满足调整 P 值截止值 0.01 并与 QIAGEN 知识库中的规范通路相关的数据集分子被纳入分析。数据集与规范通路之间关联的显著性通过两种方式衡量：1) 显示数据集映射到通路的分子数除以映射到规范通路的分子总数的比率；2) 使用右尾 Fisher 精确检验计算 p 值，以确定数据集中的基因与规范通路之间的关联仅由偶然因素解释的概率。3) 在许多情况下，计算 Z 分数以指示该通路激活或抑制的可能性。

细胞类型标记物分析
为了应对第 V 层显微切割的混合细胞组成，我们使用皮层组织中主要细胞类型的验证标记物进行了细胞类型标记物富集分析。这种方法承认组织显微切割包含多种细胞类型（神经元、胶质细胞和血管细胞），而不是纯化群体，并在不需要单细胞分离或流式细胞术的情况下为细胞类型特异性蛋白质组学特征提供证据。

标记物选择和检测
为以下细胞类型策划了细胞类型特异性蛋白标记物集：神经元 (13 个标记物)、星形胶质细胞 (6 个标记物)、少突胶质细胞 (9 个标记物)、少突胶质前体细胞/OPC (5 个标记物)、小胶质细胞 (8 个标记物)、内皮细胞 (7 个标记物) 和周细胞/平滑肌细胞 (10 个标记物)。将检测到的标记物与我们的蛋白质组学数据进行交叉参考，以计算数据集中每个标记物集存在的百分比 (图 S3C)。质谱未检测到的标记物被排除在下游分析之外，以确保统计有效性。

Z 分数归一化和标记物热图
所有样本 (TAR4/4 Atxn2 ASO 和 TAR4/4 Ctrl ASO) 中的蛋白丰度值使用按行 Z 分数转换进行标准化：
?????? = (?????? ? ????) / ????
其中 ?????? 是样品 ?? 中蛋白 ?? 的丰度，???? 是所有样本的平均丰度，???? 是标准差。这种归一化考虑了基线蛋白表达水平的差异，同时保留了样本和条件之间的相对差异。检测到的标记蛋白被组织成细胞类型组，并可视化为分层热图，Z 分数值颜色编码从?3 (低丰度，深蓝色) 到+3 (高丰度，火砖色)。

定量和统计分析
所有实验统计细节可在图例和每种方法细节的专门部分中找到。数据报告为至少三次独立实验的均值±标准误 (SEM)。统计分析使用 Graph-Pad Prism 版本 8.2 (GraphPad Software, USA) 进行。统计显著性通过两尾配对或非配对 Student's t 检验确定个体比较，单因素 ANOVA 后接 Tukey 事后检验和双因素 ANOVA 后接 Sidak 事后检验用于多重比较，差异在 p < 0.05 时被认为显著。图例中报告的'n'值表示独立实验的数量和/或每种基因型的小鼠数量。

补充信息 (4)
全部下载
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文档 S1. 图 S1–S8
电子表格 (193.20 KB)
表 S1. 表达人 TDP-43 或对照 GFP 的 pbp1Δ和野生型酵母培养物的全局蛋白质组学分析结果
电子表格 (5.13 MB)
表 S2. 经 Atxn2 或对照 ASO 处理的野生型或 TAR4/4 小鼠显微切割皮层第 5 层的全局蛋白质组学分析结果
PDF (12.63 MB)
文档 S2. 文章加补充信息