血脑屏障内皮膜跨膜转运模拟：无偏分子动力学方法与增强采样方案的系统比较

《Membranes》：Simulating Transport Across the Blood–Brain Barrier Endothelial Membrane: Comparing Unbiased Molecular Dynamics Methods to Enhanced Sampling Protocols

　　

血脑屏障（BBB）是一种高度选择性的膜结构，限制了治疗药物向脑内的递送。本篇综述评估了多种可用于评估BBB转运及中枢神经系统（CNS）递送的计算技术。我们概述了人脑微血管内皮细胞（hBMECs）的细节，以及被动转运如何作为主要转运方式。随后，我们概述了用于预测药物在全原子hBMEC模型中硅内渗透性的分子动力学技术细节。由于先验采样CNS转运所需的极慢时间尺度，我们将基于跃迁计数（TBC）方法与增强采样技术进行了比较。这些先进方法克服了传统采样限制，包括结合加权直方图分析法（WHAM）和动态直方图分析法（DHAM）的伞形采样（US）。此外，我们还考虑了结合非均匀溶解度-扩散（ISD）模型的恒速-引导分子动力学（cv-SMD）/US，以及元动力学和自适应偏置力方法。

1. 引言

神经系统疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病和癫痫等。据估计，每3名成年人中就有1人受到至少一种神经系统疾病的影响，全球约有30亿人患有神经系统疾病。这些影响人类的神经系统疾病直接或间接与中枢神经系统（CNS）及其独特的解剖特征相关。大脑和脊髓的一个重要特点是它们通过高选择性渗透屏障与血液分离：血脑屏障（BBB）、血脊髓屏障以及脉络丛中的血脑脊液屏障（BCSFB）。BBB由紧密连接、极少的转胞吞囊泡以及具有高密度线粒体以支持主动转运的人脑微血管内皮细胞（hBMECs）构成，形成称为神经血管单元的紧密组装体。hBMECs构成了调节药物跨BBB被动扩散和主动转运的主要物理屏障。在现代药物发现流程中，准确预测化合物从乙醇、地西泮等经典基准物到艾氯胺酮和zuranolone等新型FDA批准疗法的转运和渗透系数，对于减少不良药代动力学和其他临床失败具有重要意义。BBB仍然是开发更多神经药理制剂的主要生理瓶颈，仅有约2-6%的小分子药物能在CNS中达到治疗浓度。

2. BBB内皮——复杂膜的一个实例

2.1 BBB的组成：内皮细胞、紧密连接和黏附连接

BBB内皮细胞在细胞顶端（腔面）部分形成相邻细胞间的紧密连接，与黏附连接相连。紧密连接的存在阻断了小分子的细胞旁转运，从而使被动转运成为主要作用机制。内皮细胞分泌一层30-40 nm的薄血管基底膜，由IV型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素和其他细胞外基质蛋白组成。

2.2 BBB的其他组成

星形胶质细胞在确保神经元代谢、神经递质和离子摄取/再循环、突触形成以及BBB调节之外的大脑其他生物学功能中发挥重要作用。周细胞在大脑毛细血管中高度丰富，在不同血管床中密度各异。基底膜（BM）是细胞外基质的一种独特形式，提供结构支持、细胞锚定和信号转导。

2.3 BBB的功能

BBB提供了一个受控的微环境，通过维持脑中钾离子（K⁺）浓度（约2.5-2.9 mM）低于哺乳动物体内的浓度（约4.5 mM）来实现离子调节。BBB包含特定的转运蛋白和离子选择性通道，维持神经细胞通讯和功能的最佳条件。腔面Na⁺、K⁺、Cl^?协同转运体促进Na⁺、K⁺和2Cl^?从血液向内皮的转移。钙转运体（Na⁺/Ca²⁺交换体）和电压门控K⁺通道也调节跨BBB的离子转运。

2.4 小分子通过复杂膜的递送

能够轻松穿过细胞膜并在细胞质中可用的分子在生物学研究中持续需要。小分子跨膜转运通常由两种不同机制决定：主动转运和被动扩散。然而，在跨BBB转运中，相邻内皮细胞间的紧密连接限制了细胞旁被动扩散，使跨膜扩散成为主要的被动机制。因此，仅包含内皮膜组分的BBB计算模型可以达到合理的准确性。

3. 跨内皮膜的分子建模

3.1 MD模拟基础

在MD模拟中，需要求解系统中所有原子的牛顿第二定律运动方程。这需要通过Verlet算法、跳蛙算法或速度Verlet方法等算法对运动方程进行数值积分。模拟通常在正则（NVT）系综中开始，以允许膜-水盒系统平衡，随后在等温等压（NPT）系综中进行进一步平衡和生产运行。模拟盒中的压力由恒压器控制，选项包括Berendsen恒压器或Parrinello-Rahman恒压器。使用MD模拟研究膜渗透的最大陷阱之一是描述系统盒的底层能量函数不能准确代表渗透的生物学过程。该能量函数称为力场（FF），已开发了多种专门FF用于不同类型的系统，包括AMBER、CHARMM、GROMOS、OPLS、OpenMM FF和MMFF。常用水模型之一是TIP3P。

3.2 模拟通过BBB内皮的药物递送

全原子MD模拟在允许进行实验上不可见的机制观察方面已被证明很重要，包括：（1）被动扩散的能量屏障，（2）亲脂性、大小和电荷等性质，以及（3）可转化为药物生物利用度关键现象的膜通过热力学和动力学。在蛋白质介导的转运中，MD模拟可以模拟药物与转运体（如P-糖蛋白（P-gp）或ATP结合盒（ABC）转运体）的相互作用。如果全原子MD的模拟时间尺度过于受限，粗粒化（CG）MD模拟（如MARTINI 3 FF和脂质FF）为达到此类时间尺度提供了有前景的途径。尽管MD模拟具有实用性，但仍面临若干局限性，包括时间尺度限制、力场精度约束、计算成本以及构象空间采样挑战。

3.3 跨hBMECs被动膜渗透的生物物理原理

溶质跨脂质双层的被动渗透从根本上是一个多步骤过程，涉及从本体水相去溶剂化、插入脂质头基区域、跨疏水核心易位以及在远端水相中重新溶剂化。该过程的标准理论框架是ISD框架，将膜视为一系列电阻层。渗透系数（P_sim）由跨膜法线（z）的积分电阻定义。准确测量渗透系数需要精确确定热力学屏障ΔG和动力学阻力（1/D）。hBMEC膜的高胆固醇含量和致密堆积为这两个变量带来了显著挑战。脂质双层内的扩散系数D(z)是强各向异性和位置依赖的。ISD模型通常依赖爱因斯坦-斯莫卢霍夫斯基关系，从PMF和药物沿跨膜轴（z）位置的扩散系数D(z)估算小分子溶质的渗透性。

3.4 BBB原子模型

硅内渗透性研究的生理相关性强烈依赖于模型膜组成的准确性。hBMEC顶膜因其升高的鞘磷脂和胆固醇含量而与通用双层或猪脑脂质提取物显著不同，促进了与简单磷脂酰胆碱双层的液态无序相相比更具限制性的液态有序相的形成。BBB模拟模型可以使用多种工具构建，包括利用CHARMM36脂质力场和TIP3P水模型的CHARMM-GUI Membrane Builder。

3.5 BBB内皮之外的其他原子双层

与简单的液态无序磷脂酰胆碱双层不同，hBMECs的顶膜含有升高的胆固醇和鞘磷脂浓度。这些甾醇-鞘脂相互作用驱动高度限制性液态有序相的形成，显著降低了每个脂质的面积，减少了横向可压缩性，并增加了疏水核心内的脂质有序参数。为了准确捕获被动扩散的热力学屏障，计算模型必须超越简化设置。

4. 增强采样方法

已开发了多种增强采样技术，具有不同的方法论、优势和局限性，用于研究膜渗透。这些方法的实用性取决于其针对实验基准的验证。

4.1 基于跃迁计数（TBC）的无偏MD模拟

第一种方法是使用TBC的无偏MD。在此方法中，跨双层易位的速率常数k从自发跨双层溶质穿越的无偏MD模拟中计算。总转运事件数N首先估算，然后除以总模拟时间。通常使用摩尔速率常数（r = k/N_A）进行计算。

4.2 引导MD

US和引导MD（SMD）是为了解决分子生物物理学中的一个基本问题而开发的：单个蛋白质子域如何响应机械应力。SMD模拟使用恒力（cf-SMD）或恒速（cv-SMD）来研究传统MD模拟无法达到的时间尺度上的构象变化。在cv-SMD中，指定的原子或原子组以恒定速度通过虚拟谐振弹簧向外部参考点拉动，其中引导力是偏置势对集体变量/反应坐标ξ(R)的负导数。

4.3 伞形采样

伞形采样（US）可以在通过其他方法生成初始窗口后使用。在每个窗口中，施加谐振偏置势以将分子约束在特定深度z_i，窗口必须重叠以采样完整的反应坐标。PMF通常通过使用WHAM或DHAM对约束模拟的概率分布进行去偏获得。DHAM采用基于跃迁的框架，其中自由能景观被划分为多个箱，相邻状态之间的跃迁通过马尔可夫跃迁矩阵M_ij量化。通过明确考虑箱间跃迁，它减少了因瞬时捕获导致的不完全采样产生的伪影。

4.4 伞形采样-DHAM，使用马尔可夫状态建模

PMF的确定通过涉及偏置模拟和特定去偏数学框架的多步骤过程实现。系统使用伞形采样进行偏置，以确保药物分子充分采样膜的所有区域，特别是高能垒区域。DHAM用于恢复无偏跃迁矩阵M_ij，并使用最大似然估计基于偏置计数和模拟期间施加的已知偏置能量计算无偏跃迁概率。Z坐标可离散为1000个小箱，对每次模拟计算这些箱之间的观测跃迁数。自由能分布可从系统状态的平衡群体计算，该群体来自所构建MSM中跃迁矩阵的最大特征值。

4.5 元动力学

元动力学通过沿选定CV保存历史依赖偏置势来解决刚性反应坐标的局限性，以阻止系统重新访问已采样的构象状态。通过系统性地沉积历史依赖高斯势，该技术迫使药物分子逃离深层局部最小值并跨越高能垒。Well-Tempered（WT-MetaD）和Multiple-Walker Metadynamics（MW-MetaD）等变体可进一步提高效率。

4.6 自适应偏置力（ABF）

自适应偏置力（ABF）连续计算局部平均力并施加等量反向偏置力，以动态展平自由能景观，这意味着无需预定义窗口即可探索系统内的扩散性。ABF直接测量并抵消沿渗透轴的thermodynamic力，允许提取自由能分布而无需依赖模拟后去偏框架。

4.7 动力学、化合物易位和渗透性估算

要使用ISD方程计算渗透性，首先需要获得PMF，其次需要估算位置依赖扩散系数D(Z)。使用Green-Kubo关系，自相关函数C_F是力自相关函数的积分。位置依赖扩散系数D(z)可使用爱因斯坦-斯莫卢霍夫斯基关系计算。跨细胞渗透性可通过积分从US模拟获得的位置依赖分布来计算，即沿跃迁坐标Z的位置依赖扩散D(z)和自由能?G(z)，如ISD方程所示。

4.8 不同增强采样方法的比较

虽然US广泛用于评估小分子渗透，但其准确性严重依赖CV质量和空间窗口分离。当针对实验指标验证时，ABF通常达到与US相当或优于US的统计收敛性，前提是正交自由度被充分捕获。元动力学通过沿选定CV保存历史依赖偏置势来解决刚性反应坐标的局限性。尽管有这些优势，这些方法共享一个根本脆弱性：当正交弛豫时间超过模拟窗口时，垂直于所选CV的隐藏能量屏障会诱导准非遍历性，导致滞后和与实验热力学极限的系统性差异。因此，采样协议必须将增强采样与校正动力学框架配对。增强采样方法的 proliferating 的一个重要方面是它们必须针对实验基准数据进行仔细评估。