靶向萨宾脊髓灰质炎病毒2型和3型D抗原的单域抗体（VHH）制备与功能表征

《Viruses》：Generation and Characterization of Single-Domain Antibodies Against the D-Antigen of Sabin Poliovirus Types 2 and 3

　　

研究人员制备并表征了一组针对脊髓灰质炎病毒萨宾株2型和3型的单克隆纳米抗体（VHH）。针对脊髓灰质炎病毒萨宾2型，获得了4个血清型特异性单域抗体。值得注意的是，其中两个抗体S2-C5和S2-D5能够区分D抗原与H抗原。3个纳米抗体特异性中和了脊髓灰质炎病毒萨宾2型，且对同源野生型MEF-1株或其他脊髓灰质炎病毒血清型均未表现出中和活性。在针对萨宾3型筛选的4个纳米抗体中，S3-A2和S3-G1在酶联免疫吸附试验（ELISA）中显示出较高的血清型特异性。当用作ELISA捕获抗体时，S3-G1表现出对D抗原优于H抗原的优先结合。然而，3型纳米抗体未表现出病毒中和活性。所获得的抗体有望作为改进现有基于多克隆抗体的免疫检测方法的工具，通过提高D抗原特异性，并可能促进用于灭活脊髓灰质炎疫苗质量控制的下一代ELISA系统的开发。

**研究背景与现有问题**

脊髓灰质炎（脊灰）疫苗接种是预防脊灰病毒感染最有效的手段。随着全球消灭脊灰行动（GPEI）的推进，野生脊灰病毒2型和3型已被宣布全球消灭，但口服减毒活疫苗（OPV）仍可导致疫苗衍生脊灰病毒（cVDPV）循环及疫苗相关麻痹性脊灰（VAPP），因此灭活脊灰疫苗（IPV）逐渐成为优先选择。IPV的关键有效成分是D抗原（保持完整衣壳结构和病毒RNA的天然构象病毒颗粒），可诱导机体产生中和抗体。然而在加热（如56℃）或福尔马林灭活等应激条件下，D抗原可发生构象转变形成免疫原性低的H抗原（热诱导的非天然构象抗原）。目前用于IPV质量控制的传统多克隆抗体检测体系存在批次间差异大、特异性不足等局限，难以准确量化D抗原。单域抗体（VHH，即仅由重链可变区构成的纳米抗体）因分子量小、稳定性高、能识别构象表位等优势，为开发新一代检测体系提供了新途径。此前针对脊灰病毒2型和3型的纳米抗体尚未见报道。

**研究内容与主要结论**

本研究首次制备并系统表征了靶向脊灰病毒萨宾株2型和3型D抗原的纳米抗体组（panel）。研究人员以纯化灭活D抗原免疫羊驼，构建噬菌体展示文库并筛选特异性VHH克隆，通过ELISA和中和试验评估其功能。结果表明：针对2型获得的4个纳米抗体中，S2-C5和S2-D5可特异性区分D抗原与H抗原；S2-C5、S2-G9和S2-D5对萨宾2型具有特异性中和活性，IC₅₀（半数抑制浓度）分别为55.8 nM、58.2 nM和232.6 nM，且对野生型MEF-1株及其他血清型无交叉中和作用。针对3型的4个纳米抗体中，S3-A2和S3-G1表现出高血清型特异性，其中S3-G1作为捕获抗体可区分D/H抗原，但3型抗体均无中和活性。上述VHH为提高IPV质控中D抗原检测特异性提供了有价值的工具。

**关键技术方法**

研究人员采用的主要技术方法包括：（1）以纯化灭活D抗原（≥5000 DU）免疫健康成年羊驼，分离外周血单核细胞（PBMCs）并提取RNA，RT-PCR扩增VHH可变区基因后构建噬菌体展示文库；（2）经M13KO7辅助噬菌体拯救及3轮生物淘选富集特异性克隆，噬菌体ELISA筛选阳性克隆；（3）阳性克隆在大肠杆菌Rosetta细胞中表达，经固定化金属亲和层析（IMAC）纯化获得重组VHH抗体；（4）夹心ELISA评估血清型特异性和D/H抗原区分能力，Vero细胞体系测定中和活性。

**研究结果**

*羊驼免疫与文库构建*：免疫后血清抗体滴度达1:1024（2型）和1:2048（3型），噬菌体文库大小分别为5×10⁷ CFU/mL和6×10⁷ CFU/mL。

*抗体筛选与鉴定*：经3轮生物淘选，2型文库阳性率为19.4%（56/288，信噪比≥30），3型文库阳性率为28.5%（82/288，信噪比≥35）。测序确定4个抗2型和4个抗3型独特克隆，另1个3型克隆因交叉反应被排除。

*表达纯化*：成功表达并纯化出分子量约20 kDa的单体VHH抗体。

*中和活性测定*：S2-C5、S2-G9和S2-D5特异性中和萨宾2型病毒；3型全部克隆无中和活性。

*2型特异性与D/H抗原区分*：4个2型VHH均对萨宾2型D抗原高度特异；S2-C5和S2-D5仅识别D抗原，S2-G9结合两种抗原形式，S2-A1则优先结合H抗原。

*3型特异性与D/H抗原区分*：S3-A2和S3-G1具有高血清型特异性；S3-G1仅识别D抗原，S3-A2优先结合D抗原但部分结合H抗原，S3-B5和S3-H1无法区分两种抗原形式。

**讨论与结论**

研究人员指出，2型和3型筛选效率的差异可能源于两种血清型衣壳表面抗原位点的高度结构同源性；部分克隆在可溶性表达后出现交叉反应，可能与噬菌体p3蛋白去除后构象约束改变有关。相较识别多表位的多克隆抗体，纳米抗体因其狭窄特异性在区分疫苗株与野生型株及D/H抗原方面具有明显优势，VHH与多克隆抗体联用（VHH捕获+多抗检测）可进一步提高检测选择性。本研究局限性包括表位未作图、筛选文库多样性有限等。结论表明，这是首次制备并表征靶向脊灰萨宾2型和3型D抗原的VHH组，多个克隆表现出高特异性并具备区分D/H抗原的能力，为开发下一代IPV质控免疫检测方法奠定了重要基础。