铜(II)与钯(II)缩氨基硫脲配合物的抗癌及抗菌活性构效关系研究

《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》：Structure-activity relationship of Cu(II) and Pd(II) thiosemicarbazone complexes with anticancer and antibacterial properties

　　

本研究合成了12种缩氨基硫脲配体及其对应的24种Cu(II)和Pd(II)配合物，评估了它们的理化性质和生物活性。单晶X射线衍射（SC-XRD）和质谱分析证实了配体去质子化并形成中性ML2型配合物。含有3,4-二甲氧基亚苄基或4-溴亚苄基取代配体的几种配合物对黑色素瘤细胞表现出亚微摩尔级的细胞毒性。研究人员选择Cu(b-TSC)2和Pd(dm-TSC-pCl)2进行机制研究，发现它们可诱导细胞周期阻滞、促凋亡基因激活、DNA损伤和细胞凋亡。值得注意的是，Cu(b-TSC)2对维莫非尼耐药的SK-MEL-28和A-375细胞仍保持活性。构效关系分析表明，额外的氯取代通常会降低抗癌活性。计算得出的理化描述符显示，增加氯化程度会增强亲脂性并降低亲水性，这与较低的表观溶液稳定性相关。这些发现强调了在未来基于缩氨基硫脲的潜在药物设计中平衡亲脂性、亲水性和溶液稳定性的重要性。相比之下，抗菌活性更具菌株依赖性，对大肠杆菌（E. coli）的最低抑菌浓度（MIC）低至3.125 mg/L。

研究背景与研究目的

在现代药物化学领域，金属基化合物已成为开发新型治疗药物的最具前景的候选者之一。癌症发病率持续攀升，国际癌症研究机构预测全球新发病例数将从2022年的2000万增至2040年的2990万。与此同时，2019年耐药菌感染直接导致全球127万人死亡。在此背景下，寻找更有效、更安全的治疗药物成为紧迫挑战。金属配合物通常比游离有机配体表现出显著增强的生物活性，其中Cu(II)配合物因其可通过多种机制（包括产生活性氧ROS、DNA结合与切割、酶抑制）发挥作用而备受关注；Pd(II)配合物则作为Pt(II)类抗癌药物的替代品日益受到认可。缩氨基硫脲（thiosemicarbazones）是一类具有多样配位能力和生物活性的多功能配体，其合成可及性允许精细调控理化特性。已有多个含缩氨基硫脲骨架的化合物进入抗癌临床试验阶段，如Triapine (3-AP)、COTI-2和DpC。

尽管已有许多关于d电子金属缩氨基硫脲配合物的报道，但大多数研究集中于三齿配位的M(HL)Cl₂或M(L)Cl型配合物，双齿ML₂型配合物相对少见，且对其配体取代模式、金属种类、溶液行为与生物活性之间的关系尚缺乏充分理解。本研究旨在填补这一空白，系统探究不同N1和N4位取代基对Cu(II)和Pd(II) ML₂型缩氨基硫脲配合物理化性质、抗癌活性及抗菌活性的影响。

研究方法概述

研究人员首先设计并合成了12种缩氨基硫脲配体（HTSCs），分为3,4-二甲氧基亚苄基、3,4-二氯亚苄基和4-溴亚苄基三个系列，每个系列中N4位苯基取代基分别为未取代或邻位、间位、对位氯取代。随后通过一步反应将配体转化为对应的Cu(II)和Pd(II)配合物。采用单晶X射线衍射（SC-XRD）确定晶体结构，利用高分辨质谱（HRMS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和紫外-可见光谱（UV-Vis）进行表征及溶液稳定性监测。运用瑞士ADME（SwissADME）平台进行计算机模拟理化性质和药代动力学（ADME）相关描述符分析。抗癌活性评价选用SK-MEL-28、A-375和G-361三种黑色素瘤细胞系及健康BJ成纤维细胞，测定半数抑制浓度（IC₅₀）和选择性指数（SI）。选取Cu(b-TSC)₂和Pd(dm-TSC-pCl)₂进行机制研究，包括mRNA基因表达分析、细胞周期分析和膜联蛋白V（Annexin-V）凋亡检测。抗菌活性采用琼脂孔扩散法测定最低抑菌浓度（MIC）。

研究结果

设计与合成

研究人员成功合成了所有目标配体和配合物，产率良好。SC-XRD分析确认配体发生硫酮-硫醇互变异构后去质子化，形成中性ML₂型配合物，金属离子通过亚胺N3和硫醇盐S1供体原子与两个单阴离子缩氨基硫脲配体螯合，配位多面体呈四方平面（SP-4）几何构型。

SC-XRD分析

五种配体和九种配合物的晶体结构被成功解析。游离配体中C1—N1—C7—N2—N3—C8—C9链呈现反式-顺式-反式-反式（ap-sp-ap-ap）构象序列，由分子内N1—H···N3氢键稳定。配位后构象转变为顺式-反式-反式-顺式（sp-ap-ap-sp），伴随C7-S1键伸长和C7-N2键缩短，反映π电子密度重分布。Cu(II)和Pd(II)配合物之间观察到同晶现象，归因于二者相近的离子半径。氢键模式在配位后发生显著变化，N1氨基成为唯一的氢键供体。

质谱、FTIR光谱和UV-Vis监测稳定性

质谱在所有配合物中均观测到预期的[M+H]⁺峰。Cu(II)配合物在电喷雾电离条件下发生部分还原为Cu(I)。FTIR光谱显示配合物中ν(NH)吸收带显著减弱或位移，证实配体去质子化。UV-Vis稳定性实验表明，在50:50 H₂O/DMSO介质中，Pd(II)配合物的溶液稳定性普遍优于相应的Cu(II)类似物；在90:10 DCBM/DMSO介质中，所有配合物均表现出有限的表观稳定性，尤其是含3,4-二氯亚苄基配体的配合物，吸光度随时间显著下降，提示可能发生聚集和/或沉淀。

计算机模拟理化和ADME描述符分析

所有配体均满足Lipinski、Ghose、Veber和Egan类药物筛选标准。3,4-二甲氧基亚苄基衍生物的整体轮廓最优。BOILED-Egg图显示所有配体位于高概率胃肠道吸收区域，3,4-二氯亚苄基和4-溴亚苄基取代配体还位于预测血脑屏障渗透区域。所有配体均未被归类为P-糖蛋白底物。

抗癌活性——细胞毒性评价

在10 μM初筛中，游离配体大多表现弱至中等活性，而多种配合物显著抑制细胞增殖，尤其是含3,4-二甲氧基亚苄基取代基的Cu(II)和Pd(II)配合物。氯取代基的存在和位置对活性产生显著影响。基于初筛结果，选择最活跃的配合物测定IC₅₀值。Pd(dm-TSC)₂对SK-MEL-28和G-361细胞、Pd(dm-TSC-pCl)₂对G-361细胞达到亚微摩尔级IC₅₀。综合活性与选择性，选择Cu(b-TSC)₂（对SK-MEL-28和A-375，SI分别为2.28和2.94）和Pd(dm-TSC-pCl)₂（对G-361，SI=3.19）进行进一步机制研究。

基因表达分析

在SK-MEL-28细胞中，Cu(b-TSC)₂处理导致细胞周期阻滞基因CDKN1A显著上调、CCND1下调；在A-375和G-361细胞中也观察到类似趋势。所有细胞系中促凋亡基因BAX表达上升、抗凋亡基因BCL-2表达下降。DNA损伤应答基因ATM和ATR的表达变化呈现细胞系依赖性：SK-MEL-28中ATM下降、ATR不变；A-375中两者均显著上升；G-361中两者维持对照水平。抗氧化酶基因CAT和SOD-2的表达总体变化有限。

细胞周期分析

Cu(b-TSC)₂在A-375和SK-MEL-28细胞中诱导G2/M期阻滞，A-375细胞中还观察到S期比例显著增加（从5%升至20%），G1期群体明显减少。Pd(dm-TSC-pCl)₂处理G-361细胞后，亚G1期群体显著增加（从5%升至21%），提示大量凋亡细胞死亡，S期无明显变化。

凋亡检测

Cu(b-TSC)₂处理后，A-375和SK-MEL-28细胞的健康细胞比例分别从88%降至50%、从90%降至54%，早期凋亡比例分别从8%升至33%、从5%升至31%。Pd(dm-TSC-pCl)₂处理G-361细胞后，健康细胞从85%急剧降至15%，早期和晚期凋亡分别达38%和45%，坏死细胞仅占2%。

对维莫非尼耐药细胞的活性

Cu(b-TSC)₂在亲本和维莫非尼耐药的SK-MEL-28及A-375细胞中保持相当的活性，而维莫非尼在耐药细胞中的活性显著下降（SK-MEL-28中降低近100倍，A-375中降低超过5倍）。

抗癌构效关系

3,4-二甲氧基衍生物的活性最为突出。额外引入氯取代基几乎在所有情况下均降低活性。Pd(II)配合物整体IC₅₀低于相应Cu(II)配合物。计算描述符的探索性分析表明，增加亲脂性与降低活性相关，而更高亲水性与增强活性相关。高氯代配合物的UV-Vis吸光度随时间显著下降，提示过度疏水导致聚集和/或沉淀。

抗菌活性

抗菌活性更多依赖于菌株而非结构修饰。大肠杆菌（E. coli）最为敏感，MIC低至3.125 mg/L；李斯特菌（L. monocytogenes）耐受性最强。Cu(II)配合物的抗菌活性普遍优于游离配体和Pd(II)类似物。Cu(b-TSC)₂是唯一对所有五种测试菌株均表现出可观活性的化合物。

总结与结论

本研究合成了24种新的Cu(II)和Pd(II)缩氨基硫脲配合物并进行了系统表征。尽管游离配体仅表现弱细胞毒性，但多种配合物对黑色素瘤细胞显示出显著活性，特别是含3,4-二甲氧基亚苄基和4-溴亚苄基片段的配合物。Cu(b-TSC)₂和Pd(dm-TSC-pCl)₂是最具前景的化合物，分别对SK-MEL-28/A-375细胞和G-361细胞表现出高效力和选择性。机制研究表明两种配合物均诱导细胞周期阻滞和促凋亡基因激活。值得注意的是，Cu(b-TSC)₂对维莫非尼耐药黑色素瘤细胞保持活性。构效关系分析揭示，N4位苯环上的额外氯取代通常降低抗癌活性，而含3,4-二甲氧基亚苄基配体的配合物呈现最佳活性谱。这些趋势与计算理化描述符及表观溶液稳定性结果一致：更高氯代配合物具有更大计算亲脂性和更显著的随时间UV-Vis吸光度下降，提示聚集和/或沉淀倾向增加。因此，将亲脂性提升超出一定范围可能不利于生物活性，保持亲脂性、溶解度和表观溶液稳定性之间的适当平衡至关重要。与抗癌结果相反，抗菌活性较少依赖结构修饰而更多受菌株影响。Cu(b-TSC)₂是唯一对所有测试菌株均有活性的化合物。多项配体和金属配合物表现出低毫克/升级MIC值，为针对特定细菌菌株的药物开发提供了有前景的起点。