结构导向理性鉴定具有抗结直肠癌细胞增殖活性的Bcl-2靶向肽

《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》：Rational structure-guided identification of a Bcl-2-targeting peptide with antiproliferative effects on colorectal cancer cells

　　

Bcl-2对肿瘤存活至关重要，并作为有前景的抗癌药物靶点。在此，研究人员通过基于结构的虚拟筛选和系统性生物学验证鉴定了一系列新型Bcl-2靶向肽。从肽库中筛选出4个候选肽。MST（microscale thermophoresis，微量热泳动）结果表明，Peptide 1对Bcl-2表现出最强的表观结合亲和力（K_d = 0.51 ± 0.03 μM），优于VS-9和其他筛选肽。分子动力学模拟、自由能景观分析和MM/GBSA（molecular mechanics/generalized-Born surface area，分子力学/广义玻恩表面积）计算进一步支持了Bcl-2–Peptide-1复合物的预测构象特征。MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）试验表明，Peptide-1显著抑制HT29和Colo320HSR结直肠癌细胞的增殖，而对正常NCM460细胞影响有限。Bcl-2敲低减弱了Peptide-1的生物活性，RT-qPCR（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，逆转录定量聚合酶链反应）和ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定）分析显示，Peptide-1在转录和蛋白水平调控Bax/Bcl-2表达。Peptide-1代表一种有前景的Bcl-2靶向肽，对结直肠癌细胞具有抗增殖活性。

结直肠癌（colorectal cancer）是世界主要恶性肿瘤之一，发病率和死亡率高。美国预计2026年新增158,850例结直肠癌病例和55,230例死亡，疾病负担持续存在。当前结直肠癌治疗主要依赖以手术切除为中心的多模式策略，联合放疗、化疗、分子靶向治疗和免疫治疗。早期患者通常从根治性手术中获益，但晚期或转移性疾病预后仍差；显著分子异质性、复杂疾病演变以及可操作靶点缺乏持续限制临床获益。因此，开发新型靶向抑制剂是改善结直肠癌治疗结局的重要策略。Bcl-2（B-cell lymphoma 2，B细胞淋巴瘤2）作为关键抗凋亡蛋白，促进肿瘤细胞存活，已成为抗癌药物开发的既定靶点。在结直肠癌中，Bcl-2家族失调与凋亡平衡改变相关，部分表现为Bcl-2活性相对Bax介导的促凋亡效应增加。既往研究显示，Bcl-2抑制剂venetoclax与regorafenib联用在结直肠癌中具有协同抗肿瘤作用。因此，开发新型Bcl-2靶向抑制剂并系统评价其在结直肠癌中的抗肿瘤活性具有必要性。Bcl-2由四个保守的Bcl-2同源结构域（BH1–BH4，Bcl-2 homology 1–4）和C端跨膜区组成；BH1–BH3共同形成疏水结合槽，介导与促凋亡BH3-only蛋白和效应分子的相互作用。基于该结构特征，多数Bcl-2抑制剂作为BH3模拟物竞争性占据该结合槽。BH3结合槽由关键残基定义，其中Tyr108、Phe153等芳香疏水残基形成非极性环境，Asp111、Asn143、Arg146等极性或带电残基通过氢键和静电作用稳定配体结合。现有BH3模拟小分子抑制剂包括Navitoclax（ABT-263）、Venetoclax（ABT-199）和Sonrotoclax（BGB-11417），处于不同临床开发阶段。在结直肠癌中，这些药物可一定程度抑制肿瘤细胞增殖，但单药疗效有限，更常与其他治疗方式联合探索。此外，小分子抑制剂通常仅占据疏水槽的一部分，限制其完全重现天然BH3域相互作用网络的能力。在此背景下，肽基抑制剂作为替代策略受到关注；肽更接近BH3域构象特征，可形成α螺旋并占据更广泛结合界面，从而与关键残基形成更广泛相互作用，可能提高结合特异性和亲和力。大蒜来源肽VKLRSLLCS（VS-9）已被报道与Bcl-2的BH3结合槽相互作用，并在白血病细胞模型中表现抗癌活性。基于结构的虚拟筛选如分子对接可在实验验证前快速优先筛选大型分子库，缩小筛选范围，提高靶向抑制剂发现效率，并提供预测结合模式和关键分子间相互作用信息。研究人员此前已使用分子对接筛选靶向癌症相关蛋白的活性化合物。本研究采用基于结构的分子对接虚拟筛选策略，鉴定具有强Bcl-2结合能力的新型肽，并评价其对结直肠癌细胞生长的抑制作用。

研究人员构建了含59,319条序列的虚拟肽库，并针对Bcl-2（PDB ID: 9O14）进行筛选，最终从肽库中选择Peptides 1–4进行结合与体外活性评价。研究结果显示，Peptide-1具有最强表观结合亲和力（K_d = 0.51 ± 0.03 μM），优于VS-9和其他筛选肽；MD模拟、FEL分析和MM/GBSA计算支持Bcl-2–Peptide-1复合物相对稳定的构象和有利结合能量学；MTT试验表明Peptide-1抑制HT29和Colo320HSR结直肠癌细胞增殖，而对正常NCM460细胞影响有限；Bcl-2敲低减弱Peptide-1抗增殖活性；RT-qPCR和ELISA显示Peptide-1在转录和蛋白水平调节Bax/Bcl-2表达。该研究结论提示Peptide-1是有前景的Bcl-2靶向肽，并为结直肠癌靶向治疗先导肽发现及靶向蛋白-蛋白相互作用界面的肽抑制剂筛选提供策略和技术参考。

关键技术方法：研究人员在MOE（Molecular Operating Environment，分子操作环境）中通过QuaSAR-CombiGen构建含59,319条序列的虚拟肽库，基于Bcl-2晶体结构（PDB ID: 9O14）进行半柔性分子对接，按对接分数选择Peptides 1–4；采用MST（microscale thermophoresis，微量热泳动）定量重组人Bcl-2结合亲和力，并结合LigPlot+和SAR（structure–activity relationship，构效关系）分析相互作用；使用GROMACS 2021.5进行MD（molecular dynamics，分子动力学）模拟，并行MM/GBSA（molecular mechanics/generalized-Born surface area，分子力学/广义玻恩表面积）和FEL（free energy landscape，自由能景观）分析；MTT法评估抗增殖活性，shRNA（short hairpin RNA，短发夹RNA）慢病毒敲低Bcl-2，RT-qPCR（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，逆转录定量聚合酶链反应）和ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定）检测Bax/Bcl-2。细胞系LoVo、HT-29、Colo320HSR来自ATCC（American Type Culture Collection，美国典型培养物保藏中心），NCM460来自Cyagen Biotechnology，均经STR（short tandem repeat，短串联重复序列）鉴定。

基于分子对接的Bcl-2结合肽鉴定（Molecular docking-based identification of Bcl-2-binding peptides）：研究人员构建59,319条序列虚拟肽库，并针对Bcl-2（PDB ID: 9O14）进行基于结构的虚拟筛选。根据对接分数排序，选择Peptides 1–4进一步分析；Peptides 1–4均显示较低对接分数，其中Peptide-1对接分数最低，为?12.67 ± 0.77 kcal/mol，提示其预测结合最有利。

MST分析（MST analysis）：通过MST定量评价Peptides 1–4和阳性对照VS-9与重组人Bcl-2的结合亲和力。Peptide-1显示最高结合亲和力，K_d = 0.51 ± 0.03 μM；VS-9为1.14 ± 0.05 μM，Peptide-2为1.49 ± 0.15 μM，Peptide-3为4.75 ± 0.28 μM，Peptide-4为7.08 ± 0.41 μM。结果提示Peptide-1与Bcl-2相互作用相对更强。

结构-结合关系分析（Structure–binding relationship analysis）：研究人员分析Peptides 1–4预测结合构象和关键分子间相互作用。Peptides 1–4被预测容纳于Bcl-2疏水结合口袋，该口袋主要包括Val133、Leu137、Phe153和Tyr202等疏水残基，Tyr108、Asp111、Glu114、Glu136、Arg146和Asn143等极性残基参与氢键形成。LigPlot+分析显示Peptides 1–4与Bcl-2之间存在预测氢键和疏水接触。Peptide-1被预测与Val133、Leu137、Phe153和Tyr202等关键疏水残基形成多个氢键和有利疏水接触，提示更好的空间互补和预测相互作用模式；Peptides 2–4在氢键数量、极性相互作用位点和疏水接触分布上存在差异，可能与其相对较弱的结合亲和力相关。

MD模拟分析（MD simulations analysis）：为表征Bcl-2–Peptide-1复合物动态结合特征和构象稳定性，研究人员进行MD模拟。复合物骨架RMSD在短暂初始调整后进入相对稳定区间，主要维持在0.2–0.3 nm；Bcl-2多数残基RMSF较低，仅溶剂暴露柔性环区有限波动；R_g维持在1.45–1.50 nm且分布集中；Bcl-2与Peptide-1之间氢键数量相对稳定；总、疏水和亲水SASA无显著变化；Bcl-2二级结构稳定，未见明显α螺旋向无规卷曲转变。结果提示Peptide-1结合未破坏Bcl-2整体结构框架，复合物在动态条件下保持相对稳定构象。

MM/GBSA分析（MM/GBSA analysis）：研究人员通过MM/GBSA结合自由能计算和能量分解分析评估Bcl-2–Peptide-1复合物热力学稳定性。总结合自由能为负，提示Bcl-2与Peptide-1相互作用在能量上有利。能量组分分析显示，范德华和静电相互作用为主要有利贡献，极性溶剂化能为主要不利项，非极性溶剂化能提供次要有利贡献。每残基能量分解显示，多数界面残基呈负能量贡献，若干残基贡献更明显；有利残基贡献主要来自范德华和静电相互作用，极性溶剂化对部分残基有抵消作用。结果与分子对接和相互作用分析一致。

Bcl-2–Peptide-1复合物的自由能景观分析（Free energy landscape analysis of the Bcl-2–Peptide-1 complex）：研究人员以RMSD和R_g为反应坐标构建FEL。二维自由能等高图显示复合物主要集中于低能区，对应RMSD约0.15–0.22 nm、R_g约1.45–1.48 nm；三维自由能面显示明显能量盆地，提示复合物构象分布相对集中。将平衡MD轨迹分为5–25 ns和25–50 ns两个独立片段后，FEL低能区相似，提示主要构象态在模拟期间被一致采样。

MTT分析（MTT analysis）：MTT试验显示Peptides 1–4和VS-9以不同效力抑制LoVo细胞活力。Peptide-1的IC₅₀最低，为0.92 ± 0.06 μM；VS-9为2.90 ± 0.17 μM，Peptide-2为3.86 ± 0.22 μM，Peptide-3为8.14 ± 0.53 μM，Peptide-4大于10 μM。Peptide-1对HT-29和CoLo320HSR结直肠癌细胞系具有抑制效应，IC₅₀分别为1.26 ± 0.07 μM和1.48 ± 0.11 μM；正常NCM460细胞对Peptide-1敏感性较低，IC₅₀大于10 μM。shRNA介导Bcl-2敲低后，Peptide-1对shControl LoVo细胞的IC₅₀为0.92 ± 0.06 μM，而shBcl-2 LoVo细胞中IC₅₀大于10 μM，提示Peptide-1细胞活性可能与Bcl-2表达相关。

凋亡相关分子变化分析（Analysis of apoptosis-associated molecular changes）：RT-qPCR检测显示，Peptide-1处理后促凋亡基因Bax mRNA表达增加，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达降低，10 μM时更明显。ELISA进一步显示，Peptide-1处理增加Bax蛋白水平并降低Bcl-2蛋白水平。结果提示Peptide-1调节凋亡相关分子表达，形成与促凋亡信号相关的分子谱。

讨论与结论部分总结：本研究通过整合分子对接、MST结合试验、SAR分析、MD模拟和体外评价的基于结构虚拟筛选策略，成功鉴定与BH3结合槽相互作用的新型Bcl-2靶向肽。Peptide-1对接分数最低，预测在Bcl-2疏水口袋中形成最有利相互作用网络；MST证实其结合亲和力最强，K_d = 0.51 ± 0.03 μM；SAR和相互作用分析提示Peptide-1中极性或带电残基与疏水残基的协同排列有利于稳定氢键形成并与关键Bcl-2口袋残基互补；MD模拟和FEL分析支持Bcl-2–Peptide-1复合物在模拟轨迹中保持相对稳定构象；MM/GBSA表明复合物稳定性主要由范德华和静电相互作用驱动，关键界面残基对肽识别和复合物稳定有显著能量贡献。MTT试验显示Peptide-1对结直肠癌细胞系HT29和Colo320HSR具有抗增殖作用，而对正常结肠上皮NCM460细胞细胞毒性低；LoVo细胞中Bcl-2敲低减弱Peptide-1抗增殖活性，提示Bcl-2表达可能参与其细胞活性；Peptide-1处理在转录和蛋白水平改变Bax和Bcl-2表达，提示Bcl-2家族相关分子变化参与。结论翻译：本研究中筛选的Peptide 1表现出高结合亲和力、稳定结合构象和良好肿瘤选择性，支持其作为Bcl-2靶向肽候选物进一步研究。该研究不仅为结直肠癌靶向治疗提供创新先导肽，也为靶向蛋白-蛋白相互作用界面的肽抑制剂筛选提供可靠研究策略和技术参考。