基于苯并噁嗪骨架的高选择性MAP4K4抑制剂F389-0736的优化及其在胰腺癌细胞中的机制解析

《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》：Optimisation and mechanistic characterization of a selective benzoxazine-based MAP4K4 inhibitor in pancreatic cancer cells

　　

胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）仍是一种致死性恶性肿瘤，可用的靶向治疗选择十分有限。丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4（Mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 4, MAP4K4）已被证实参与PDAC的进展，但有效MAP4K4抑制剂的开发仍需在效力、选择性和机制解析方面进一步提升。研究人员此前鉴定出F389-0746作为一种基于苯并噁嗪的选择性MAP4K4抑制剂，在胰腺癌中具有抗肿瘤活性。在本研究中，研究人员以F389-0746的骨架为指导，筛选并评估了苯并噁嗪类类似物，随后对活性最强的类似物进行了生化、结构、选择性和细胞层面的表征。在所鉴定的类似物中，F389-0736表现出最强的MAP4K4抑制活性，其半数抑制浓度（IC50）为44.0 nM，较F389-0746提高了约三倍。分子对接和构效关系（Structure-activity relationship, SAR）分析确定了关键的结合相互作用，支持F389-0736在MAP4K4结合口袋中增强的效力。激酶谱分析进一步证明了F389-0736在所测试的激酶panel中对MAP4K4的选择性。细胞热位移分析（Cellular thermal shift assay, CETSA）进一步证明F389-0736诱导MAP4K4的热稳定性增加，支持其细胞内靶点结合。在胰腺癌细胞中，F389-0736抑制了TAK1、JNK和p38的磷酸化，并显著降低了细胞活力和增殖，IC50值分别为4.41–4.65 μM，半数生长抑制浓度（GI50）值分别为4.03–5.12 μM。F389-0736还抑制了克隆形成生长，诱导亚G1期细胞积累并激活凋亡信号。RNA测序鉴定出398个差异表达基因，并揭示了炎症和应激反应通路、程序性细胞死亡程序、致癌信号扰动和代谢重编程的富集。这些发现将F389-0736确定为一种强效且选择性的基于苯并噁嗪的MAP4K4抑制剂，支持其作为化学探针和先导骨架用于研究胰腺癌中MAP4K4依赖性信号传导及治疗脆弱性。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是致死率最高的恶性肿瘤之一，在美国癌症相关死亡原因中排名第三，并预计在不久的将来上升至第二位。该疾病以诊断延迟和靶向治疗选择有限为特征，目前标准治疗方案仍依赖FOLFIRINOX和吉西他滨联合白蛋白紫杉醇等全身化疗方案，五年生存率仅约13%。尽管针对BRCA突变、MSI-H和NTRK融合的靶向疗法已获批准，但受益患者不足10%，凸显了发现新激酶靶点和开发新型靶向疗法的迫切性。

丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4（MAP4K4），又称HGK，已被证实是PDAC的潜在治疗靶点。MAP4K4在胰腺癌组织和细胞系中过表达，其高表达水平与肿瘤体积增大、疾病分期进展和淋巴结转移直接相关。MAP4K4通过磷酸化MLK3激活下游JNK信号，驱动细胞增殖、侵袭和转移。遗传敲低或药理抑制MAP4K4可抑制PDAC细胞增殖、集落形成和迁移，并诱导G1期阻滞和凋亡。然而，尽管MAP4K4是经过验证的治疗靶点，目前尚无抑制剂进入癌症临床评估阶段。已有多个亚微摩尔效力的候选化合物因激酶选择性不足而未能实现临床转化，如GNE-495对MINK1和MLK1有活性，PF-06745013抑制TRKC和FLT3，CHEMBL3326802抑制MINK1和FLT3。脱靶抑制MINK1可能通过稳定Hippo通路中的YAP降低抗肿瘤疗效，而FLT3抑制可能通过树突状细胞耗竭损害抗肿瘤免疫。因此，开发高选择性MAP4K4抑制剂是胰腺癌治疗的关键需求。

研究人员此前通过基于结构的虚拟筛选开发了基于苯并噁嗪的MAP4K4抑制剂F389-0746，其IC₅₀为120.7 nM，具有高选择性，能有效抑制JNK信号并在体内异种移植模型中显示出与吉西他滨相当的肿瘤生长抑制作用。但该化合物仍有 potency 提升空间，且MAP4K4抑制的下游机制尚未完全阐明。基于此，本研究旨在利用F389-0746骨架开发效力更强、选择性更高的苯并噁嗪类MAP4K4抑制剂，并通过转录组分析深入解析其作用机制。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员从ChemDiv化合物库（约160万化合物）中筛选保留F389-0746关键结构基团（Group 2和Group 3）的类似物，采用分子对接（基于MAP4K4晶体结构PDB ID: 4OBP，使用LeadIT软件）预测结合模式，通过基于荧光共振能量转移（FRET）的Z′LYTE生化激酶实验测定抑制活性，利用Thermo Fisher Scientific的SelectScreen?激酶谱分析服务评估选择性，采用细胞热位移分析（CETSA）验证细胞内靶点结合，通过MTT法、磺酰罗丹明B（SRB）染色和集落形成实验评估抗肿瘤活性，运用流式细胞术分析细胞周期，通过蛋白质印迹（Western blot）检测信号通路和凋亡相关蛋白，最后利用Illumina NovaSeq 6000平台进行RNA测序（RNA-seq）并使用DESeq2分析差异表达基因。

三、研究结果

1. 苯并噁嗪类MAP4K4类似物的鉴定与评估

研究人员从ChemDiv数据库筛选出7个保留F389-0746关键结构基团的类似物，其中6个在1 μM浓度下显示超过50%的抑制活性。三个活性最强的化合物被选作IC₅₀测定，F389-0736表现出最高效力，IC₅₀为44.0 nM，较F389-0746（120.7 nM）提高约三倍。

2. F389-0736的相互作用分析

分子对接显示F389-0736可分为四个结构基团：Group 1的碱性哌嗪取代基与D115的羧基形成两个氢键；Group 2的氮原子作为氢键供体与D115形成额外氢键；Group 3的苯并噁嗪骨架模拟腺嘌呤部分，与铰链区残基C108主链形成两个氢键，并与V31、F107和L160形成多个疏水相互作用；Group 4的苯环与Y36侧链形成π-π相互作用，并与V39、A52、K54、M105和V170形成疏水接触。

3. 构效关系分析

对28个类似物的构效关系分析表明，R₂位点的含氮杂环通过D115盐桥增强效力，而R₁位点的氯代苯环取代通过K54和M105的疏水接触改善活性。F389-0736的哌嗪取代基与D115形成双盐桥，而F389-0746的苯硫酚基团仅与R310形成单一氢键，这解释了F389-0736效力提高约三倍的原因。

4. MAP4K4抑制剂的结构多样性

相似性矩阵分析表明，F389-0736与已知MAP4K4抑制剂的最大Tanimoto分数仅为0.204（与CHEMBL2006765），证明苯并噁嗪系列与已报道的MAP4K4抑制剂在结构上显著不同，具有结构新颖性。

5. F389-0736的选择性谱

在300 nM浓度下，MAP4K4表现出最大的抑制（残留活性17%），而大多数其他测试激酶保留超过50%的活性。对STE20家族激酶MAP4K1、PAK4和STK24的抑制可忽略不计，MINK1保留35%残留活性。浓度反应分析显示F389-0736对MAP4K4的IC₅₀为44.0 nM，对MINK1为172.2 nM，对MYO3A和MYO3B均大于10 μM，表明其具有高选择性。

6. F389-0736在胰腺癌细胞中结合MAP4K4并抑制下游信号

CETSA实验表明F389-0736处理导致MAP4K4在高温下可溶性蛋白保留增加，支持细胞内靶点结合。Western blot分析显示F389-0736浓度依赖性地降低Mia PaCa-2和Panc-1细胞中TAK1、JNK和p38的磷酸化水平，而总JNK和总p38水平基本不变，表明化合物主要影响这些信号蛋白的激活状态。

7. F389-0736在胰腺癌细胞中的抗癌活性

MTT实验显示F389-0736处理72小时后降低两种细胞系的细胞活力，IC₅₀分别为4.41 μM（Mia PaCa-2）和4.65 μM（Panc-1）。SRB染色显示其抑制细胞增殖，GI₅₀分别为4.03 μM和5.12 μM。集落形成实验表明F389-0736显著减少两种细胞系的长期克隆形成能力，在Mia PaCa-2细胞中10 μM浓度下近乎完全抑制。

8. F389-0736诱导亚G1期积累和凋亡信号

流式细胞术分析显示10 μM F389-0736显著增加两种细胞系的亚G1期细胞比例，提示诱导凋亡性细胞死亡。Western blot分析显示F389-0736降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达，增加cleaved PARP和cleaved caspase-3水平，同时降低caspase-9和caspase-3水平，表明激活线粒体介导的凋亡信号。

9. F389-0736介导的胰腺癌细胞抑制的转录组特征

RNA-seq分析鉴定出398个差异表达基因（|log₂FC| > 2，校正p < 0.01）。显著上调的基因包括炎症和应激反应基因（TNF、TRAF1、TNFRSF9、NFKB2、IL1A、IL1B、CXCL8、BIRC3、CSF3、HMOX1）以及即刻早期反应转录因子（FOS、JUNB、EGR1-4、ATF3）。显著下调的肿瘤相关基因包括ZNF488、KRT80、ADORA1、IGFBP4和PSRC1。KEGG通路富集分析显示富集的通路包括TNF信号、NF-κB信号、IL-17信号、JAK-STAT信号、NOD样受体信号、C型凝集素受体信号等炎症和细胞因子通路，以及凋亡、铁死亡、坏死性凋亡和自噬等程序性细胞死亡通路，同时MAPK、PI3K-Akt和HIF-1等致癌信号通路以及萜类骨架生物合成、果糖和甘露糖代谢等代谢通路也发生扰动。

四、讨论与结论

讨论部分指出，F389-0736在酶学实验和细胞实验中的效力差异可归因于"细胞效力衰减"（cell drop off）现象。构效关系分析确定了MAP4K4抑制的最佳药效团特征：Group 1的含氮杂环、Group 2的酰胺连接子、Group 3的苯并噁嗪核心和Group 4的氯代苯取代基。与已知MAP4K4抑制剂比较发现，超过85%的抑制剂（包括F389-0736）与铰链区和内部区域的保守残基结合，而D115和K54的参与可能与高抑制效力相关。RNA-seq结果支持F389-0736通过抑制MAP4K4依赖性激酶信号、诱导炎症应激反应和细胞死亡相关转录程序来损害胰腺癌细胞适应性。计算机模拟ADMET预测显示F389-0736具有较好的药物相似性和吸收特性，但高血浆蛋白结合率和小于3小时的消除半衰期提示需要进一步的实验药代动力学评估。研究局限性在于缺乏体内抗肿瘤疗效、药代动力学和毒性研究。

结论部分指出，本研究将F389-0736确定为一种强效且选择性的基于苯并噁嗪的MAP4K4抑制剂，在胰腺癌细胞中具有抗癌活性。F389-0736较先前的F389-0746具有改善的MAP4K4抑制效力，其机制涉及D115关键相互作用和结合口袋内的疏水接触。CETSA证明F389-0736处理后MAP4K4热稳定性增加，支持细胞内靶点结合。功能上，F389-0736抑制TAK1/JNK/p38信号，降低细胞活力、增殖和克隆形成能力，诱导亚G1期积累并激活凋亡标志物。转录组分析揭示了涉及应激反应、程序性细胞死亡、致癌信号破坏和代谢适应的广泛分子重编程。这些发现支持F389-0736作为研究MAP4K4依赖性信号传导的化学探针，以及开发胰腺癌选择性MAP4K4靶向策略的有前景的先导骨架。