ATP-柠檬酸裂解酶（ACLY）及其抑制剂研究进展：代谢-表观遗传学视角

《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》：Research progress on ATP-citrate lyase and its inhibitors: a metabolic-epigenetic perspective

　　

ATP-柠檬酸裂解酶（ACLY）是细胞代谢中的关键酶，催化柠檬酸裂解产生乙酰辅酶A（acetyl-CoA），从而桥接能量代谢与表观遗传调控。乙酰辅酶A是新生脂质合成（DNL）和组蛋白乙酰化的共同底物。ACLY活性异常与多种病理状态密切相关，包括代谢性疾病、免疫介导的炎症性疾病（IMIDs）、癌症和神经退行性疾病，使ACLY成为这些疾病的重要治疗靶点。然而，现有抑制剂面临选择性不足、临床疗效有限和脱靶效应等挑战。本综述在ACLY代谢-表观遗传双重功能的总体框架下，从三个视角系统总结了ACLY的分子机制和病理意义，即其结构与功能、疾病相关性以及抑制剂开发与优化策略，旨在为靶向ACLY的精准治疗提供理论基础。

论文主体内容总结

结构与催化机制

基因定位与全长结构

ACLY主要定位于细胞质中，富集于核周内质网区域，但在某些细胞类型的细胞核中也可检测到其存在。人源ACLY（hACLY）由17q21染色体上的ACLY基因编码，以同源四聚体形式发挥功能，与大鼠直系同源蛋白具有约98%的序列一致性。每个亚基包含1101个氨基酸残基（约120 kDa），含有六个结构域，从N端到C端依次为结构域3、4、5、1、2以及C端柠檬酸合酶（CS）结构域。其中结构域3和4构成ATP-grasp折叠（ATP结合区），结构域5形成柠檬酸结合位点，结构域1介导CoA结合，结构域2含有关键催化残基His760，其磷酸化是活性调控的核心。C端CS结构域共同构成四聚体的中央刚性核心。ACLY的四级结构呈"蝴蝶形"构象，四个亚基通过CS结构域形成中央核心，N端结构域以D2对称排列于两侧。从模块化角度看，N端结构域3、4、5构成柠檬酸裂解酶柠檬酸-CoA合酶（CCS）β亚基，结构域1和2构成CCS α亚基，二者紧密缔合形成CCS模块；C端CS结构域单独构成柠檬酸-CoA裂解酶（CCL）模块。值得注意的是，ACLY的CS结构域与经典柠檬酸合酶仅有约20%的序列一致性，且缺乏完整的催化残基，因此不具有柠檬酸合酶活性，而主要作为柠檬酰-CoA裂解酶发挥作用。

ACLY的生物学功能

ACLY在脂质代谢活跃的组织中高表达，如肝脏、肾脏、脑、胰腺β细胞和脂肪细胞。作为细胞质乙酰辅酶A的主要来源，ACLY是连接线粒体能量代谢与细胞质合成代谢的关键枢纽。其催化反应遵循有序机制：Mg2?和ATP首先结合ACLY，ATP的γ-磷酸基团瞬时转移至催化残基His760形成磷酸组氨酸中间体；ADP离开后，柠檬酸和CoA依次结合，磷酸基团随后从磷酸组氨酸转移至柠檬酸的羟基，生成高能中间体柠檬酰-磷酸；CoA随即攻击柠檬酰-磷酸形成柠檬酰-CoA，ACLY发生约35 ?的构象变化将其裂解为乙酰辅酶A和草酰乙酸（OAA），ATP最终水解为ADP和Pi。乙酰辅酶A作为乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的主要底物，驱动脂肪酸合酶（FASN）介导的碳链延伸，从而在ACLY、ACC和FASN之间建立紧密偶联的功能关系。此外，乙酰辅酶A还是胆固醇合成中甲羟戊酸途径的起始单元，其可用性显著影响3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶的代谢通量。另一产物草酰乙酸可被苹果酸脱氢酶转化为苹果酸，或进一步经苹果酸酶转化为丙酮酸并伴随NADPH生成，参与糖异生、补充三羧酸（TCA）循环中间体并维持细胞质氧化还原平衡。在表观遗传层面，乙酰辅酶A是核内表观遗传修饰的重要底物。在多种刺激（如DNA损伤、炎症信号、缺氧、饥饿和化疗）下，ACLY通过AKT等激酶介导的Thr447/Ser451/Ser455多位点磷酸化促进其核转位，与p300、组蛋白乙酰转移酶1（HAT1）或赖氨酸乙酰转移酶2A（KAT2A）等形成功能复合物，在染色质附近催化局部浓缩乙酰辅酶A池的生成，为组蛋白和非组蛋白乙酰化提供底物。值得注意的是，ACLY的调控被整合进复杂的代谢网络中，表现出显著的反馈和补偿特征。例如，肝细胞特异性敲低ACLY可降低乙酰辅酶A水平，但可能稳定转录因子甾醇反应元件结合蛋白-1c（SREBP-1c），导致补偿性分子如乙酰辅酶A合成酶2（ACSS2）的转录上调；ACLY活性抑制降低胆固醇合成后，可通过甾醇反应元件结合蛋白2（SREBP2）通路上调低密度脂蛋白（LDL）受体表达进行补偿。

ACLY在疾病中的作用

代谢性疾病

在代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）中，ACLY表现出双重角色，其功能在"代谢驱动"和"表观遗传驱动"之间随病理阶段发生情境依赖性转变。早期单纯性脂肪变性阶段，ACLY作为关键限速酶催化柠檬酸裂解产生乙酰辅酶A，活性升高，主要参与脂质合成；乙酰辅酶A不仅是DNL的主要碳源，也是棕榈酸和甘油三酯的前体，直接驱动肝脏脂质积累。随着疾病进展至纤维化和炎症阶段，ACLY的表观遗传调控功能日益凸显。MASH肝组织中高表达的ACLY增强核内乙酰辅酶A池，促进组蛋白乙酰化，进而上调多种脂质合成限速酶和促炎细胞因子（如TNF-α、IL-6和IL-1β）的转录。临床转化方面，BGT-002（化合物18，326E）作为首个进入MASH临床试验的ACLY/过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）双靶点调节剂，每日一次口服给药在MASH患者中耐受性良好（NCT06491576），治疗28天后肝脏脂肪含量降低超过30%的初步应答率为50%（安慰剂组为25%）。在高脂血症中，ACLY通过催化产生乙酰辅酶A为肝脏DNL提供碳源，导致脂肪酸和胆固醇过度生成。首个获批的ACLY抑制剂贝派地酸（化合物13，ETC-1002）在针对他汀不耐受或他汀治疗后血脂控制不佳的高胆固醇血症患者的III期临床试验中显示出显著LDL-C降低效果。关键的CLEAR Outcomes试验（NCT02993406；n=13,970）显示，治疗6个月后LDL-C水平较安慰剂降低21.1%。机制研究表明，化合物13不仅抑制ACLY的胞质催化活性和核内表观遗传功能，还直接结合并激活PPARα促进脂肪酸β-氧化，形成"抑制合成与促进分解"的双重协同机制。在动脉粥样硬化中，ACLY在全身和局部两个层面驱动疾病进展。在血管平滑肌细胞（VSMCs）中，ACLY通过促进糖酵解（即Warburg效应）、脂质合成和GCN5依赖性组蛋白乙酰化促进细胞异常增殖、迁移和抗凋亡表型。在小鼠股动脉导丝损伤模型中，化合物13治疗2周显著抑制VSMC增殖和去分化，减少新生内膜形成。CLEAR Outcomes试验显示，化合物13将他汀不耐受高胆固醇血症患者的主要不良心血管事件（MACE）风险降低13%（HR 0.87，95% CI 0.79–0.96，P=0.004）；在肥胖亚组（BMI≥30 kg/m2）中风险降低达23%。

免疫介导的炎症性疾病

在类风湿关节炎（RA）中，ACLY通过代谢-表观遗传-炎症三重机制发挥重要驱动作用。滑膜微环境中升高的中性粒细胞胞外陷阱（NETs）可直接激活ACLY，触发DNL，促进成纤维样滑膜细胞（FLSs）的增殖、迁移和侵袭能力。同时，ACLY通过产生乙酰辅酶A促进NF-κB p65亚基的非组蛋白乙酰化，促进其核转位和DNA结合能力，激活NF-κB信号通路，促成IL-1β和TNF-α等促炎因子的转录，形成自我强化的代谢-炎症正反馈环路。更根本的机制在于RA患者细胞中ACLY的结构性失调：RNA结合基序蛋白25（RBM25）下调导致Acly基因外显子14跳跃，产生组成型激活的短异构体Acly-S，该异构体促进巨噬细胞糖酵解和乙酰辅酶A产生，通过组蛋白H3K9ac/H3K27ac修饰上调促炎基因表达。在巨噬细胞特异性RBM25缺陷小鼠中，这种剪接异常诱导自发性关节炎；给予ACLY抑制剂BMS-303141（化合物21）可显著缓解该病理表型。在炎症性肠病（IBD）中，ACLY通过调控CD4?T细胞分化平衡发挥重要作用。ACLY通过Kelch样蛋白25（KLHL25）介导的泛素化调控自身蛋白稳定性，决定乙酰辅酶A通量和脂肪酸合成（FAS）/脂肪酸氧化（FAO）代谢开关，该开关是控制CD4?T细胞分化为Th17或诱导性调节性T细胞（iTreg）的核心代谢开关。在DSS诱导的实验性结肠炎小鼠模型和IBD患者中，浸润炎症肠道的CD4?T细胞（及CD8?T细胞）中ACLY表达显著下调。此外，IBD患者肠上皮中ACSS2表达显著下调，其缺陷可直接损害屏障功能并加重结肠炎，提示乙酰辅酶A代谢紊乱造成的上皮屏障损伤与T细胞促炎效应通过"上皮屏障破坏-免疫细胞活化"的正反馈环路相互耦合。

癌症

肿瘤的发生和恶性进展高度依赖持续增殖信号、代谢重编程和转移能力获得。ACLY产生的乙酰辅酶A不仅作为脂质合成底物和组蛋白乙酰化供体，还驱动多种非组蛋白的乙酰化，为肿瘤生长提供代谢和表观遗传双重支持。上游增殖信号调控ACLY表达和活性，使其成为连接致癌突变与代谢-表观遗传重编程的重要节点。在胰腺癌中，KRAS基因突变驱动ACLY过表达和激活，导致乙酰辅酶A代谢重编程在癌前阶段即已启动。ACLY自身的翻译后修饰进一步精细调控其功能：在肺癌中，PCAF介导ACLY在K540、K546和K554位点的乙酰化，阻断其泛素化和蛋白酶体降解，增强ACLY稳定性以支持肿瘤生长；SIRT2介导的去乙酰化则降低ACLY稳定性。在胶质母细胞瘤中，PI3Kβ磷酸化OGT，OGT进而介导ACLY的O-GlcNAc修饰（T639/S667），激活的ACLY促进乙酰辅酶A产生，同时促进脂肪酸合成和组蛋白H3乙酰化。在肿瘤转移过程中，ACLY通过多种机制支持癌细胞在应激微环境中的存活和播散。在食管鳞状细胞癌中，FAK/Src激酶磷酸化ACLY的Tyr542/652位点，促进其活性并支持转移淋巴结中肿瘤细胞的存活和增殖。在肝细胞癌中，内质网应激激活IRE1α激酶，磷酸化SEC63从而稳定ACLY；ACLY不仅协同上调Snail1表达促进癌细胞转移，还增加乙酰辅酶A供应以支持内质网稳态。ACLY的作用还延伸至肿瘤微环境，参与免疫逃逸、化疗耐药和免疫重塑。在宫颈癌中，P4HA3通过竞争性抑制E3泛素连接酶UBR4与ACLY的相互作用来稳定ACLY蛋白，ACLY来源的乙酰辅酶A通过增强SLC7A11启动子区域H3K27ac水平促进其转录，最终赋予铁死亡抵抗并驱动宫颈癌淋巴转移。在黑色素瘤中，ACLY产生的乙酰辅酶A通过P300介导的组蛋白H3K27ac乙酰化促进PD-L1转录和表达，介导肿瘤免疫逃逸。在肝细胞癌中，化疗药物诱导乙酰转移酶NAT10在K468位点乙酰化ACLY，促进ACLY在核内积累，通过增加核内乙酰辅酶A池和H3K27ac水平激活CYP2C9和PIK3R1等化疗耐药基因的转录。

神经退行性疾病

在代谢性疾病、IMIDs和癌症中，ACLY失调通常表现为过度激活。然而在神经系统中，神经元是终末分化细胞，其病理特征并非增殖而是蛋白质稳态失衡、能量代谢功能障碍和突触丢失。在阿尔茨海默病（AD）中，ACLY表达和活性对维持α-微管蛋白乙酰化和V-ATP酶组装至关重要。AD患者和模型小鼠中神经元ACLY水平降低导致α-微管蛋白乙酰化下降和微管稳定性受损，进而阻碍V-ATP酶组装和溶酶体酸化，最终导致自噬通量受损和Aβ沉积增强。相反，在帕金森病（PD）中，α-突触核蛋白基因突变可过度激活ACLY，导致细胞质中乙酰辅酶A积累和p300乙酰转移酶在细胞质中滞留并异常激活，通过mTORC1过度激活阻断自噬通量。在PD病理背景下，特异性ACLY抑制剂羟基柠檬酸（化合物2，HCA）和化合物10可有效降低细胞质乙酰辅酶A水平，促进p300核转位，恢复自噬功能，增强α-突触核蛋白聚集体的清除，并改善人iPSC来源神经元、脑类器官、斑马鱼和小鼠模型中的运动缺陷和神经元死亡等病理表型。

ACLY抑制剂开发与分子设计

柠檬酸类似物

羟基柠檬酸（化合物2，HCA）是从藤黄果中分离的首个报道的ACLY抑制剂（K_i=8 μM），通过竞争性抑制柠檬酸结合来抑制乙酰辅酶A产生。Wells等人将C-F键引入柠檬酸（化合物1），经手性拆分获得(3R)-(+)-2,2-二氟柠檬酸（化合物3，K_i=0.7 μM），为选择性ACLY抑制剂。Dolle等人通过模拟CoA或其反应中间体设计合成了亚磺酰亚胺类抑制剂（如化合物5），但结合亲和力较弱（K_i=250 μM）；进一步开发的环氧化物衍生物（化合物6和7）旨在通过活性位点共价修饰实现不可逆抑制，但效力有限（K_i分别为18 μM和400 μM）。Gribble等人构建了一系列具有疏水性"柠檬酸样"头基的化合物（化合物8a-b；K_i=1.2–3.3 μM），但细胞通透性差。通过SAR优化和前药设计，开发了SB-201076（化合物9，K_i=1 μM）及其前药SB-204990（化合物10）。

二羧酸类似物

Bar-Tana等人报道了二羧酸类ACLY抑制剂Medica 16（化合物11），通过模拟柠檬酸占据底物结合口袋，K_i为16 μM。在此基础上，研究者将β-二甲基替换为硫原子得到化合物12。Esperion Therapeutics开发了贝派地酸（化合物13，ETC-1002），于2020年获FDA和EMA批准用于治疗高胆固醇血症。化合物13是前药，由肝脏酶极长链酰基辅酶A合成酶-1（ACSVL1）转化为活性形式ETC-1002-CoA（化合物20，K_i=2 μM），直接抑制ACLY。Li等人从长链烯烃二酸骨架化合物14（IC₅₀=55.7 μM）出发，经迭代取代基筛选得到强效ACLY抑制剂化合物15（IC₅₀=1.5 μM）。基于结构分析提示ACLY结合口袋中存在未充分利用的疏水空腔，团队通过酯化衍生化策略引入2,4-二氯苯乙基部分得到化合物16（IC₅₀=3.1 μM）。以化合物15为起点，通过基于片段的药物设计策略和迭代SAR优化，设计了三齿状骨架化合物17（IC₅₀=0.87 μM），该化合物在肝细胞癌（HCC）小鼠模型中显示出减少肿瘤负荷和肝纤维化的体内疗效。由此系列衍生出的326E（化合物18；活性代谢物IC₅₀=5.31 μM）于2022年进入高胆固醇血症临床试验。此外，Gregory R. Steinberg团队报道了ACLY/ACSS2双靶点抑制剂EVT0185（化合物19；活性代谢物ACLY IC₅₀=2.5 μM，ACSS2 IC₅₀=45 μM），该化合物在肝脏中被SLC27A2转化为活性CoA硫酯，直接与ACLY的CoA结合口袋相互作用，在MASH小鼠模型中减轻脂肪变性、肝星状细胞活化和纤维化。

磺酰胺类似物

2007年，百时美施贵宝通过高通量筛选鉴定了一系列2-羟基-N-苯基磺酰胺化合物，其中强效类似物为BMS-303141（化合物21，IC₅₀=0.13 μM），可有效抑制HepG2细胞中的脂质合成。2019年，Wei等人报道了同系物NDI-091143（化合物22，IC₅₀=2.1 nM），效力较BMS-303141增强，但在人肝微粒体中半衰期较短（T_1/2=3.36 min）。共晶结构显示NDI-091143以U形折叠构象结合ACLY的变构位点，酚羟基与Gly380主链酰胺形成氢键，磺酰胺氮与Arg378羰基形成氢键供体，酚羟基与磺酰胺基团之间的分子内氢键进一步稳定该U形构象。2022年，Zang等人应用环化策略对NDI-091143进行构象约束，得到大环化合物23。分子对接显示化合物23维持关键相互作用：酚羟基与Gly380、磺酰胺氮与Arg378、磺酰胺氧与Ile344，其芳香环与Phe347和Phe354发生π-π堆积。尽管化合物23的效力有所下降（IC₅₀=69.7 nM），但其在人肝微粒体中的代谢稳定性显著改善（T_1/2=531 min）。后续SAR研究确认酚羟基的重要性，在联苯位置引入溴原子得到化合物24，保持良好效力（IC₅₀=8.3 nM）的同时改善了药代动力学性质。

黄酮类似物

2022年，Wang等人通过对138种黄酮衍生物进行高通量筛选，鉴定了一系列ACLY抑制剂（IC₅₀=0.47–0.86 μM），活性最高的化合物包括草棉黄素（化合物25a，IC₅₀=0.5 μM）、槲皮素（化合物25b，IC₅₀=0.86 μM）、木犀草素（化合物25c，IC₅₀=0.64 μM）、野黄芩苷（化合物25d，IC₅₀=0.71 μM）和杨梅素（化合物25e，IC₅₀=0.47 μM）。SAR研究揭示邻二羟基苯基与吡喃酮环形成的共轭体系对抑制活性至关重要，而5-羟甲基化导致活性丧失。酶动力学分析将化合物25a表征为非竞争性抑制剂，K_i值分别为0.11 μM（针对柠檬酸）和0.19 μM（针对CoA），提示结合于变构位点。分子对接表明草棉黄素与Asn346、Thr348、Asn349和Thr353形成氢键，其苯环与Phe354发生π-π堆积。

呋喃羧酸类似物

1985年，Hall等人报道2-糠酸（化合物26）和3-糠酸可在啮齿动物肝脏中抑制ACLY活性，但所需浓度较高。2017年，Jernigan等人以2-糠酸为骨架进行虚拟筛选，鉴定出呋喃羧酸衍生物，其中5-磺酰胺苯并呋喃-3-羧酸衍生物化合物27（IC₅₀=13.8 μM）和4-取代-2-糠酸类似物化合物28a（IC₅₀=4.1 μM）活性最强，其同系物化合物28b（IC₅₀=11.9 μM）活性较弱。SAR分析提示化合物28a的R₂取代基延伸至疏水亚口袋，形成额外疏水或π-π堆积相互作用。

蒽醌类似物

1995年，Oleynek等人从真菌培养物SC2193中分离出一系列ACLY抑制剂，其中最有效的是2-氯-1,3,8-三羟基-6-甲基-10H-蒽-9-酮（化合物29，IC₅₀=283 nM，K_i<100 nM）。结构相似的大黄素（化合物30）缺乏C-2氯原子，活性降低，但其蒽醌骨架具有更好的稳定性。Koerner等人随后基于大黄素骨架进行SAR研究，确认C-2位取代基的关键重要性，发现C-4位引入溴原子可进一步增强与变构位点疏水残基的相互作用。在C-2和C-4位均带有溴原子的化合物31（IC₅₀=2.9 μM）是该系列中活性最强的类似物之一。

查尔酮骨架类似物

基于多种天然ACLY抑制剂的SAR研究，Xu等人设计合成了系列查尔酮类化合物（化合物32），其中含五元环的衍生物（化合物33）和刚性苯并呋喃骨架的衍生物（化合物34）显示出强效活性（IC₅₀分别为36 nM和22 nM）。分子对接提示化合物33与ACLY的Gly341、Gly380和Pro382等残基形成氢键，并与Phe347发生π-π堆积；化合物34与Arg378形成氢键，并与Tyr307和Phe354发生π-π堆积。在高脂饮食诱导的MASH小鼠模型中，给予化合物33或34可减轻肝脏脂肪变性、系统性胰岛素抵抗和氧化应激。

其他ACLY抑制剂

1993年，Chan等人从海洋海绵Iotrochota sp.中分离出生物碱purpurone（化合物35），在偶联酶测定中IC₅₀为7 μM，呈剂量依赖性抑制ACLY活性，减少HepG2细胞中脂肪酸合成，且无细胞毒性。1997年，Barrow等人从链霉菌中发现一系列抗霉素型ACLY抑制剂，其特征为独特的9元双内酯环连接3-羧酰胺水杨酸部分。