《Biology》：Exploratory Profiling of Extracellular Vesicles and Citrullinated Proteins in Plasma of Greenland Shark Somniosus microcephalus
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格陵兰鲨（Somniosus microcephalus）是地球上寿命最长的脊椎动物，估计寿命至少可达272年。其代谢缓慢，并能耐受高压和低温环境，但其独特的生理机制至今仍知之甚少。蛋白质瓜氨酸化（脱亚胺化）是一种由肽酰精氨酸脱亚胺酶（PADs）在钙离子依赖方
格陵兰鲨（Somniosus microcephalus）是地球上寿命最长的脊椎动物，估计寿命至少可达272年。其代谢缓慢，并能耐受高压和低温环境，但其独特的生理机制至今仍知之甚少。蛋白质瓜氨酸化（脱亚胺化）是一种由肽酰精氨酸脱亚胺酶（PADs）在钙离子依赖方式下催化精氨酸转化为瓜氨酸的翻译后修饰。蛋白质瓜氨酸化会改变电荷、构象及下游蛋白质折叠，从而影响蛋白质功能和蛋白质-蛋白质相互作用。瓜氨酸化还与细胞外囊泡（EV）通讯相关，而EV通讯在细胞-细胞相互作用中至关重要。这项探索性研究聚焦于从血浆中富集F95泛瓜氨酸化蛋白，并从两份存档的格陵兰鲨血浆样本（一份来自2010年采集的单条鲨鱼，储存于?20 °C；另一份为2015年采集的三条鲨鱼混合样本，储存于?80 °C）中鉴定血浆EV。研究人员对EV进行了EV标志物标记，并通过单分子检测的超分辨显微技术确认瓜氨酸化蛋白与EV共定位。通过LC-MS/MS鉴定了EV富集组分中EV相关总蛋白，共鉴定出76种（另有7种未表征）蛋白质，通过通路注释分析（10条KEGG、37条Reactome和30条生物学过程GO通路），这些蛋白质与多种免疫、氧化应激、DNA复制、细胞衰老及代谢通路相关。此外，对格陵兰鲨血浆中F95富集（泛瓜氨酸化）蛋白的LC-MS/MS分析鉴定出75个蛋白质命中（另有6种未表征蛋白），这些蛋白与9条KEGG、38条Reactome和25条生物学过程GO通路注释相关，涉及基因调控、应激与免疫应答、化学稳态、代谢和细胞信号传导。鉴于格陵兰鲨是极端长寿物种，且能耐受低温和高压环境，对其EV介导过程及瓜氨酸化靶蛋白的理解，可能为该物种独特的生理适应性提供见解。
论文解读
一、研究背景与意义
格陵兰鲨（Somniosus microcephalus）是地球上已知寿命最长的脊椎动物，估计寿命可达272年甚至长达400年。该物种栖息于北大西洋深层冷水域，可耐受接近3000米深度的巨大水压以及低至?1.1 °C的亚零温度环境。格陵兰鲨具有缓慢的代谢和生长速率、大型幼体体型以及异常高的繁殖力（每胎200–324尾幼鲨）。其多种代谢适应性包括高水平的氧化三甲胺（TMAO），参与渗透调节并可能降低体液冰点，同时保护蛋白质免受高浓度尿素等去稳定因素影响。此外，其血红蛋白相比温带鲨鱼已进化出适应性的氧亲和力降低。格陵兰鲨的极端长寿、可忽略的衰老表型以及可能影响衰老多个标志（包括基因组稳定性、蛋白质稳态和细胞间通讯）的独特生物学特征，使其成为人类长寿研究的重要关注物种。
目前对该物种血浆中细胞外囊泡（EV）的谱系特征及其蛋白质货物知之甚少，对其血浆中瓜氨酸化蛋白靶标也缺乏系统鉴定。蛋白质瓜氨酸化是一种由肽酰精氨酸脱亚胺酶（PADs）催化的翻译后修饰，将精氨酸转化为瓜氨酸，改变蛋白质电荷、疏水性和折叠方式，进而影响蛋白质功能及蛋白质-蛋白质相互作用。瓜氨酸化还参与EV生物发生和细胞间通讯。鉴于格陵兰鲨独特的生理特征，理解其EV介导的通讯机制及血浆中瓜氨酸化蛋白靶标，可能为人类生理和病理生物学研究提供有价值的参考信息。
二、研究内容与主要发现
本研究利用两份存档的格陵兰鲨血浆样本（样本A来自2010年TUNU IV考察采集的单条鲨鱼，储存于?20 °C；样本B为2015年TUNU VI考察采集的三条鲨鱼混合血浆，储存于?80 °C），开展了EV谱系分析和瓜氨酸化蛋白富集鉴定。研究确认了血浆EV的粒径分布主要在60–350 nm范围，EV平均粒径为178–251 nm，众数粒径为126–190 nm。通过Western blotting确认了CD63和Flotillin-1等EV表面标志物的存在，并通过透射电子显微镜（TEM）和直接随机光学重构显微技术（dSTORM）实现了EV的可视化和单分子检测。
研究发现，使用磷脂酰丝氨酸（PS）捕获方式比四旋蛋白三体（TT）捕获方式对格陵兰鲨血浆EV具有更高的结合效率。约68–77%的EV呈PanEV标志物阳性，22–31%的EV同时呈PanEV和TT双阳性。瓜氨酸化蛋白检测显示，约4.3–7.3%的PanEV阳性EV和11.7–18.9%的PanEV-TT双阳性EV携带瓜氨酸化蛋白信号，首次以单分子检测水平确认了瓜氨酸化蛋白与格陵兰鲨血浆EV的共定位。
通过LC-MS/MS蛋白质组学分析，在EV富集组分中共鉴定出76种蛋白质（另有7种未表征蛋白），这些蛋白与免疫、氧化应激、DNA复制、细胞衰老和代谢等关键通路相关。在F95富集的候选瓜氨酸化蛋白中，共鉴定出75种蛋白质（另有6种未表征蛋白），涉及基因调控、应激与免疫应答、化学稳态、代谢和细胞信号传导等通路。Western blotting确认了格陵兰鲨血浆中存在PAD2蛋白（预期70–75 kDa大小范围）。
三、关键技术方法
本研究采用了以下主要技术方法：血浆样本来自挪威UiT北极大学的两份存档样本，分别于2010年（TUNU IV考察，单条鲨鱼）和2015年（TUNU VI考察，三条鲨鱼混合）在格陵兰东北部采集。EV富集采用差速离心法；EV表征采用纳米颗粒追踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）和Western blotting；单分子超分辨成像采用dSTORM技术结合ONI商业试剂盒，通过PS捕获EV并进行多色标记检测；候选瓜氨酸化蛋白采用F95泛瓜氨酸化抗体进行免疫沉淀富集；蛋白质鉴定采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），数据库检索使用UniProt软骨鱼数据库；通路注释分析采用STRING数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用网络和KEGG、Reactome及GO通路富集分析。
四、研究结果
4.1 EV富集组分的表征
通过NTA分析确认EV浓度约为2×101?颗粒/mL，粒径范围主要在60–350 nm。Western blotting确认CD63（30–65 kDa）和Flotillin-1（约35 kDa）的表达。TEM和dSTORM成像实现了EV的可视化。PS捕获比TT捕获具有显著更高的EV结合效率，样本B的结合颗粒数高于样本A。阳性EV标记分析显示，大多数EV呈PanEV阳性（约68–77%），22–31%呈PanEV-TT双阳性，TT单阳性EV可忽略不计（≤1%）。
4.2 瓜氨酸化蛋白与EV的共定位
通过dSTORM单分子检测，确认了瓜氨酸化蛋白（F95阳性）与PanEV阳性EV的共定位率为4.3–7.3%，与PanEV-TT双阳性EV的共定位率为11.7–18.9%。阴性对照确认无背景非特异性染色。
4.3 EV富集组分的LC-MS/MS分析及通路注释
共鉴定出76种蛋白质和7种未表征蛋白。基于人STRING数据库鉴定出10条KEGG通路；基于竹鲨（Chiloscyllium punctatum）数据库鉴定出37条Reactome通路（31个蛋白命中）；基于澳大利亚鬼鲨（Callorhinchus milii）数据库鉴定出30条生物学过程GO通路（37个蛋白命中）。通路涉及免疫应答、补体系统、糖酵解/糖异生、碳代谢、嘌呤代谢、DNA复制、细胞衰老、HIF-1信号传导等。
4.4 F95富集瓜氨酸化蛋白的LC-MS/MS分析及通路注释
共鉴定出75种蛋白质和6种未表征蛋白。基于人STRING数据库鉴定出9条KEGG通路；基于云纹猫鲨（Scyliorhinus torazame）数据库鉴定出38条Reactome通路（33个蛋白命中）；基于竹鲨数据库鉴定出25条生物学过程GO通路（30个蛋白命中）。通路涉及补体和凝血级联、糖酵解/糖异生、氨基酸生物合成、B细胞和NF-κB通路、整合素和MAPK信号通路、铁转运和稳态、急性期反应、伤口愈合等。
五、讨论与结论
讨论部分指出，EV相关蛋白涉及免疫、代谢和氧化应激相关通路，补体成分（C1、C3、C4、C6、C8）在EV组分中被鉴定，其中C3和C4同时也是候选瓜氨酸化蛋白靶标，与护士鲨中的报道一致。分泌型IgW重链在EV组分中被鉴定，属于鲨鱼适应性免疫的重要免疫球蛋白亚型。血红蛋白亚基在EV和F95富集组分中均有检出，但需考虑存档样本中溶血的可能影响。HIF-1信号通路和应激反应通路与EV蛋白相关，可能与格陵兰鲨对冷水环境和深海高压的适应性有关。黑色素转铁蛋白在EV和F95富集组分中均被鉴定，该蛋白参与铁代谢和缺氧反应，其与格陵兰鲨长寿和铁死亡通路的潜在关联值得关注。多种组蛋白（H2A、H4等）在EV和F95富集组分中被鉴定，与格陵兰鲨基因组研究中发现的染色质稳定性增强特征可能相关。肌联蛋白（Titin）作为候选瓜氨酸化蛋白被鉴定，鉴于其在心脏功能中的关键作用，其瓜氨酸化修饰的功能意义有待未来研究。
研究结论：本研究对格陵兰鲨血浆细胞外囊泡进行了表征，包括超分辨显微成像和蛋白质组学分析，同时对两份存档血浆样本中的瓜氨酸化富集蛋白进行了分析。EV富集血浆组分的探索性蛋白质组学分析与关键免疫、氧化应激、DNA复制、细胞衰老和代谢通路相关。F95富集的瓜氨酸化血浆蛋白谱与基因调控、应激和免疫应答、化学稳态、代谢和细胞信号传导通路相关。通过dSTORM单分子检测进一步确认了瓜氨酸化蛋白与单个EV的共定位。研究结果增进了对格陵兰鲨免疫和生理细胞机制的有限认知，其作为长寿和极端环境适应研究的未充分开发物种，可能为比较人类生理和病理生物学研究提供参考价值。
