STIM1与STIM2的差异互作决定中枢突触效能

《Cell Reports》：Divergent interplay between STIM1 and STIM2 sets the efficacy of central synapses

　　

基质相互作用分子（stromal interaction molecules, STIMs）是内质网（endoplasmic reticulum, ER）驻留的钙（Ca²⁺）传感器，调节Ca²⁺稳态。哺乳动物表达两种异构体，STIM1和STIM2，但它们在神经传递中发挥冗余还是不同作用仍知之甚少。研究人员利用Ca²⁺成像和电生理学，在缺乏STIM1、STIM2或两者均缺乏的海马神经元中，检测了STIMs在兴奋性和抑制性突触的突触前和突触后功能。两种异构体冗余激活钙库操纵性Ca²⁺内流（store-operated Ca²⁺ entry, SOCE），并放大突触前Ca²⁺内流，通过扩大突触囊泡的易释放池（readily releasable pool of synaptic vesicles）和加速囊泡再补充来维持神经递质释放。这些突触前作用具有突触特异性：STIM1主要支持兴奋性突触，而STIM2对抑制性突触至关重要。在突触后，STIM1和STIM2对谷氨酸和GABA受体水平产生相反作用，因此同时缺失两种异构体可挽救突触后功能。总之，这些发现表明，STIM1和STIM2根据突触类型和亚细胞区室差异性地调节突触效能。

研究背景与问题：钙（Ca²⁺）是调节神经元发育、功能及退化相关过程的中心信使。电压门控Ca²⁺通道（voltage-gated Ca²⁺ channels, VGCCs）将动作电位（action potentials, APs）到达与神经递质释放偶联，是突触传递起始所必需。但VGCC不足以完全支持突触前神经递质释放，包括谷氨酸、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）等递质分泌可由内质网（endoplasmic reticulum, ER）Ca²⁺释放放大和维持。突触后，神经递质激活受体并触发突触可塑性信号级联，也高度依赖ER Ca²⁺释放。ER Ca²⁺耗竭触发钙库操纵性Ca²⁺内流（store-operated Ca²⁺ entry, SOCE）。SOCE由ER Ca²⁺传感蛋白基质相互作用分子1和2（stromal interaction molecules 1 and 2, STIM1和STIM2）启动，它们在ER-质膜连接处激活Orai（或Ca²⁺释放激活通道，CRAC），随后由肌/内质网Ca²⁺ ATP酶（sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca²⁺ ATPase, SERCA）恢复ER Ca²⁺。STIM1和STIM2各自被提出调节不同神经元生理过程，但很少在同一研究中比较，且几乎从未一起消除，因此其在中枢突触中是必需、冗余还是不同仍不清楚。研究人员通过敲低每种异构体或两者，研究成熟海马兴奋性和抑制性突触的突触前、突触后功能。结果表明，STIM1和STIM2在触发突触前SOCE以维持谷氨酸和GABA释放中互补，而在突触后生理中功能分歧，证明STIMs在维持AP驱动突触传递效能中的基础作用。

关键技术方法：研究使用来自产后第1–2天SAS Sprague-Dawley大鼠（Charles River, SAS SD Strain Code 400）的原代解离海马培养物。主要方法包括：针对STIM1、STIM2或两者的短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）敲低（knock-down, KD）及双敲低（double knock-down, DKD）；活细胞Ca²⁺成像，使用Syb2-GCaMP6f、PSD95-GCaMP6f、ER-GCaMP150、iGluSnFR4f和iGABASnFR2等探针；全细胞膜片钳电生理记录微小兴奋性突触后电流（miniature excitatory postsynaptic current, mEPSC）、兴奋性突触后电流（excitatory postsynaptic current, EPSC）、微小抑制性突触后电流（miniature inhibitory postsynaptic current, mIPSC）、抑制性突触后电流（inhibitory postsynaptic current, IPSC）及高渗蔗糖反应；免疫印迹、免疫荧光共定位和电子显微镜；药理学阻断Orai、RyR和IP₃R；定制MATLAB脚本分析。

研究结果：消除所有STIM异构体不影响兴奋性突触数目。研究人员用shRNA KD使STIM1降低87%±13%、STIM2降低83%±16%、双敲>90%，无异构体代偿上调，Orai1水平无显著变化。PSD95与VGluT1共定位定量显示各组兴奋性突触密度无差异，提示STIM缺失不影响成熟海马解离神经元兴奋性突触稳定或维持，至少至DIV 22。

STIM1和STIM2在设定突触后强度中作用不同。PSD95-GCaMP6f检测显示，STIM2 KD增加单AP突触后Ca²⁺幅度，STIM1 KD减慢衰减，双敲叠加。mEPSC中，STIM2 KD增加幅度，STIM1 KD降低幅度，频率无变化；双敲使幅度恢复对照。表面AMPAR亚基检测显示，STIM2 KD和DKD增加GluR1表面水平，STIM1 KD降低；GluR2表面和总蛋白无变化。因此STIM1和STIM2分别是突触后强度的正、负调控者；双敲增加GluR1但不增加突触后活动，提示突触前释放和/或受体组织改变。

STIM1和STIM2对持续活动期间最佳突触前Ca²⁺内流和谷氨酸释放均必要。Syb2-GCaMP6f显示单AP时各组无显著差异；40 Hz高频刺激时单敲轻微降低幅度，双敲约降低50%并加速衰减，STIM1 KD出现后峰下冲。EPSC中STIM缺失降低幅度，1 Hz快速抑制，10 Hz未能易化并加速抑制，双敲部分恢复易化。累积EPSC分析显示STIM1和/或STIM2消除降低囊泡补充率，STIM1 KD降低校正易释放池（corrected readily releasable pool, RRP_CORR）；高渗蔗糖和电镜也显示STIM1 KD和DKD RRP减少。iGluSnFR4f显示释放概率降低，STIM2 KD活性区对接囊泡更多但功能释放位点无变化；囊泡直径减小、形态变异增加。

STIM1是异步兴奋性神经传递的主要驱动者。单AP EPSC累积电荷转移无显著差异，但DKD趋势更快。40 Hz后异步总电荷转移仅STIM1 KD减少，STIM1 KD与DKD无差异，表明仅STIM1参与异步谷氨酸释放。PSD95-GCaMP6f显示STIM缺失降低高频突触后Ca²⁺幅度，STIM2 KD影响较轻；刺激后衰减更快，双敲低于基线，支持兴奋性异步传递减少且Ca²⁺清除增强。

SOCE在动作电位发放期间由ER Ca²⁺耗竭激活。急性阻断Orai（BTP2/YM 58483 300 nM；zegocractin/CM-4620 1 μM）导致EPSC幅度降低趋势、加速抑制、损害短期易化并减少异步传递。阻断RyR和IP₃R不影响EPSC幅度但加速抑制，表明ER Ca²⁺释放是维持谷氨酸释放所必需。ER-GCaMP150显示1 Hz刺激引起ER Ca²⁺快速减少后约2 s恢复；40 Hz先快速释放后过冲。STIM1/2 DKD减少负面积、增加过冲，Ret4增加且SERCA2在STIM1 KD轴突增加、DKD减少，提示Ca²⁺缓冲增加与SOCE减少共同导致突触前谷氨酸释放缺陷。

SOCE介导抑制性异步神经传递但仅STIM2调节GABA能突触强度。抑制性突触密度无差异。IPSC中仅STIM2 KD显示AP诱发幅度增加趋势；高频刺激下STIM缺失加速抑制，异步GABA释放减少，双敲最强。STIM2消除比STIM1导致更快抑制和异步减少。高渗蔗糖显示STIM2 KD增加RRP，STIM1无作用。iGABASnFR2显示STIM2 KD和DKD轻微增加GABA释放概率和峰值；mIPSC频率无差异，STIM2 KD增加幅度。结果表明STIM2是突触前GABA释放和突触后GABA受体水平的负调控者；双敲可功能挽救自发性传递，STIM1和STIM2通过不同机制相反调节不同突触强度。

讨论部分总结：研究人员旨在解剖STIM1和STIM2在突触传递中的冗余与特异性功能，比较兴奋性和抑制性突触的突触前和突触后作用。既往研究通常一次检查一种STIM异构体，很少同时消除两者，且多聚焦兴奋性谷氨酸能突触。本数据显示，突触前STIM1和STIM2在响应重复AP发放触发SOCE中作用相似，由此产生的Ca²⁺内流对维持神经递质释放稳健性必不可少；STIM1对SOCE介导的谷氨酸释放更重要，STIM2是GABA释放主要驱动者。突触后STIM1和STIM2相反调节神经递质受体水平，影响突触强度。消除STIM蛋白还影响ER Ca²⁺缓冲能力，提示其在协调细胞内钙动态中有更广泛作用。STIM1和STIM2在不同突触类型和亚细胞区室的分歧作用可能作为可塑性底物，神经元可通过调节STIM异构体相对丰度调控特定Ca²⁺动态和网络特性。讨论还指出STIMs影响突触囊泡形态，缺失STIM导致多形性囊泡增加，可能源于内吞和囊泡再形成缺陷；ER-PM接触和脂质交换可能也受影响。双敲对某些释放表型的“挽救”可能因释放概率降低而防止囊泡耗竭。局限性包括囊泡形态和量子大小机制未明、共聚焦分辨率不足以确认ER形态改变、H1启动子缺乏组织特异性导致所有神经元类型同时敲低、DIV约16后才达最大敲低效率，因此不能断言STIM1和STIM2在神经元和突触发育中的作用。

研究结论翻译：总之，这些发现表明，STIM1和STIM2根据突触类型和亚细胞区室差异性地调节突触效能。