罗非鱼皮肤黏液蛋白质组在生命周期与寄生虫感染下的动态变化：从先天屏障到适应性免疫的转变

《Biology》：Life-Stage and Parasite-Induced Shifts in the Skin Mucus Proteome of Nile tilapia (Oreochromis niloticus)

　　

尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）皮肤黏液作为抵御水生病原体的关键初级防线，但其发育阶段及感染诱导的蛋白质组动态特征尚不明确。本研究采用基于液相色谱-串联质谱（LC-MS）的比较蛋白质组学技术，表征了不同发育阶段及单殖吸虫 Cichlidarus cichlidarum 感染期间罗非鱼皮肤黏液的蛋白质谱。分析共鉴定出7950种蛋白质，其中1192种为核心共有蛋白，主要与维持物理屏障完整性、氧化应激响应及病原识别相关。研究人员在幼鱼中鉴定出1328种特异性蛋白，富集于有机磷酸酯代谢过程、细胞骨架蛋白结合及水解酶活性、补体与凝血级联反应及吞噬体通路；而在成鱼中鉴定出833种特异性蛋白，与大分子分解代谢过程、NOD样受体（NLR）信号、趋化因子信号、白细胞跨内皮迁移及Toll样受体（TLR）信号相关。这表明幼鱼罗非鱼皮肤黏液以高代谢活性和先天免疫效应分子为特征，用于广谱防御环境微生物，而成鱼则整合先天-适应机制以实现靶向病原清除。在 C. cichlidarum 感染后，罗非鱼皮肤黏液中显著上调的1343种蛋白勾勒出一个高度协调的防御网络。功能富集分析显示，这些蛋白主要与催化活性相关，并显著参与吞噬体、C型凝集素受体（CLR）信号、PI3K-Akt信号、趋化因子信号及补体与凝血级联反应等关键信号通路。此外，在受感染罗非鱼的黏液中鉴定出64种来源于 C. cichlidarum 的蛋白，包括热休克同源蛋白70（HSC70）、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、钙调蛋白及硫氧还蛋白过氧化物酶。这些蛋白可能参与 C. cichlidarum 的宿主入侵或免疫逃逸。该结果揭示了鱼类黏膜免疫的可塑性，并为未来功能表征提供了潜在靶点。

一、研究背景

尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）是全球重要的水产养殖物种，年产量超过450万吨，然而寄生虫病对其健康与可持续发展构成严重威胁。单殖吸虫（monogeneans）如 Cichlidarus cichlidarum（异名：Gyrodactylus cichlidarum）是罗非鱼养殖中尤为普遍且危害严重的寄生虫，它们通过几丁质锚钩附着，造成机械损伤并引发局部炎症。鱼类皮肤黏液覆盖于上皮表面，是抵御病原的第一道防线，含有粘蛋白、溶菌酶、补体蛋白、凝集素、抗菌肽及免疫球蛋白等多种先天免疫组分。为对抗宿主防御，寄生虫利用其排泄分泌蛋白（ESPs）双向调控宿主的生理与免疫应答，例如某些寄生虫来源的粘附蛋白促进附着，而其他分泌因子可降解宿主防御屏障。尽管已有研究证实鱼类皮肤黏液具有杀灭寄生虫的能力，但关于罗非鱼在不同发育阶段及寄生虫挑战下皮肤黏液蛋白质组的动态变化仍知之甚少。因此，研究人员提出假设：鱼类皮肤黏液的蛋白质组成随发育阶段和寄生虫感染而变化，反映不同的黏膜免疫应答模式，并在一定程度上阐明寄生虫-宿主黏膜相互作用的机制。

二、研究内容与结论

为验证上述假设，研究人员开展了寄生虫感染实验，并结合液相色谱-串联质谱（LC-MS）技术，对幼鱼和成鱼 O. niloticus 以及经 C. cichlidarum 感染的 O. niloticus 的皮肤黏液蛋白质组进行了表征。实验所用罗非鱼购自广东省罗非鱼良种中心（广州，中国），在实验室循环水养殖系统中于25°C驯化。用于感染的 C. cichlidarum 取自实验室维持的种群，该种群先前已在 O. niloticus 宿主上建立。感染实验中，每条鱼暴露于携带约100条 C. cichlidarum 的鳍碎片，感染24小时后检测寄生虫负荷（分别为52、58、52、40和75条/鱼）。随后收集感染鱼的皮肤黏液作为感染组样品。此外，还分别采集了5尾健康幼鱼（体重1.0±0.6 g；体长3.7±0.6 cm）和3尾成鱼（体重365.6±62.6 g；体长27.0±1.4 cm）的皮肤黏液作为对照。由于个体幼鱼和感染鱼分泌的黏液体积有限，不足以进行单独的LC-MS/MS分析，因此将同一实验组内个体的样品合并后进行后续分析。

三、关键技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   液相色谱-串联质谱（LC-MS）：使用UltiMate 3000超高效液相色谱（UHPLC）系统与Q-Exactive HF X质谱仪联用，采用数据依赖性采集（DDA）模式，对胰蛋白酶消化后的肽段进行分离和鉴定。
2. 2.
   蛋白质鉴定与定量：使用Mascot v2.3.02软件将串联质谱数据分别与 Oreochromis niloticus 蛋白质数据库（GCA_001858045.3，来自Ensembl）和 C. cichlidarum 数据库（NCBI BioProject: PRJNA1229812）进行比对搜索，并通过Percolator在1%假发现率（FDR）水平过滤。采用基于强度的绝对定量（iBAQ）算法进行蛋白质丰度估算。
3. 3.
   生物信息学分析：对鉴定到的蛋白质进行基因本体论（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。

四、研究结果

4.1 罗非鱼黏液中由质谱鉴定的蛋白质

通过质谱分析，在幼鱼、成鱼和感染组中分别鉴定出2771、2276和2858种蛋白质，对应匹配谱图数分别为16279、11158和15411。各组质量指标一致，平均蛋白质序列覆盖率为5%。

4.2 罗非鱼皮肤黏液蛋白质组图谱

三个组共鉴定出7905种蛋白质，其中1192种为三组共有核心蛋白。功能富集分析表明，这些共有蛋白与蛋白质生物合成过程、翻译、核糖核蛋白复合物、结构分子活性及氧化还原酶活性等GO条目相关；KEGG通路富集于碳代谢、紧密连接、黏着斑、MAPK信号、NOD样受体信号和C型凝集素受体信号等通路。高丰度的共有蛋白包括MHC II类抗原α、胱抑素、丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin）、半乳糖凝集素、过氧化物氧化还原酶、C型凝集素、硫氧还蛋白、补体C3、纤维蛋白原C端结构域蛋白等，这些蛋白参与促进炎症、对抗氧化应激及保护免疫细胞免受氧化损伤。

4.3 罗非鱼不同发育阶段皮肤黏液蛋白质组的组成差异

比较幼鱼和成鱼组特异性蛋白：幼鱼有1328种特异性蛋白，富集于有机磷酸酯代谢过程、肌动蛋白细胞骨架组织、线粒体包膜、氧化还原酶活性、细胞骨架蛋白结合和水解酶活性等GO条目；KEGG通路富集于金黄色葡萄球菌感染、吞噬体、细胞粘附分子（CAM）相互作用、补体和凝血级联反应及PI3K-Akt信号通路。成鱼有833种特异性蛋白，富集于大分子分解代谢过程、RNA加工、细胞内含蛋白复合物、核糖核蛋白复合物、细胞骨架蛋白结合和肌动蛋白结合等GO条目；KEGG通路富集于MAPK信号、紧密连接、黏着斑、NOD样受体信号、趋化因子信号、白细胞跨内皮迁移和Toll样受体信号通路。

4.4 C. cichlidarum 诱导幼鱼罗非鱼皮肤黏液蛋白质组重编程

比较幼鱼和感染组：感染组有1123种独特检测蛋白，另有220种蛋白丰度显著升高。这些独特和上调蛋白主要包括IgM重链可变区（VH）、补体C3a、补体C9、泛素结合酶、整合素α2、干扰素诱导蛋白35、钙网蛋白、凋亡蛋白酶激活因子1、蛋白酶体亚基β、液泡蛋白分选35（VPS35）、桩蛋白、纤连蛋白III型、MHC II β、颗粒酶K、间质胶原酶、选择素E、金属内肽酶、甘露糖结合凝集素2、Sestrin 2、C型凝集素、组织蛋白酶B、凝溶胶蛋白、角蛋白和丝氨酸蛋白酶抑制剂。这些蛋白主要涉及RNA生物合成过程、蛋白质生物合成过程、核糖核蛋白复合物、ATP依赖性活性、催化活性和结构分子活性等GO条目；KEGG通路富集于吞噬体、NOD样受体信号、C型凝集素受体信号、黏着斑、PI3K-Akt信号、碳代谢、MAPK信号、趋化因子信号及补体和凝血级联反应。

4.5 感染罗非鱼皮肤黏液中的 C. cichlidarum 来源蛋白

在感染罗非鱼皮肤黏液中鉴定出64种特异归属于 C. cichlidarum 数据库的蛋白。KEGG通路富集于紧密连接、Rap1信号、黏着斑、蛋白酶体、心肌细胞肾上腺素能信号、Hippo信号和PI3K-Akt信号通路。其中17种蛋白可能参与免疫逃逸或宿主-寄生虫互作，主要包括肌球蛋白、肌动蛋白、钙调蛋白、热休克同源蛋白70（HSC70）、微管蛋白、硫氧还蛋白过氧化物酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。

五、讨论与结论

讨论总结： 三个实验组共有的1192种蛋白构成了核心黏膜蛋白质组，支撑着发育稳定性和环境适应所需的基本生理功能，包括维持物理屏障完整性、氧化还原稳态、先天免疫识别和抗原呈递。幼鱼和成鱼皮肤黏液的蛋白质组成差异表明，黏膜免疫系统发生了从代谢驱动的非特异性先天防御向受体介导的特异性免疫的个体发育转变。幼鱼依赖高代谢活性和基础先天免疫以支持快速躯体发育，而成鱼则拥有更成熟的模式识别受体（PRR）网络，能够启动更复杂的适应性免疫应答。在 C. cichlidarum 感染后，皮肤黏液中显著上调的蛋白构成了多层防御网络，涉及炎症反应、细胞骨架重组、补体激活和抗原呈递。同时，感染也诱导了代谢重编程以满足免疫细胞的能量需求。值得注意的是，在感染罗非鱼黏液中鉴定出的多种 C. cichlidarum 来源蛋白，如HSC70、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、钙调蛋白和硫氧还蛋白过氧化物酶，被推断参与寄生虫的宿主入侵或免疫逃逸。这些蛋白可作为药物和疫苗开发的潜在靶点。本研究的局限性在于每组仅有一个合并样本进行LC-MS分析，缺乏生物学重复，无法确定组间蛋白丰度差异的统计学显著性，因此结果应视为初步的和产生假说的。

研究结论翻译： 寄生虫入侵与宿主免疫防御之间的相互作用是一个动态过程，皮肤黏液是这种分子串扰启动的首要界面。本研究揭示了 Oreochromis niloticus 皮肤黏液的核心蛋白质组主要与维持物理屏障完整性、响应氧化应激及促进病原识别相关。与幼鱼相比，成鱼罗非鱼皮肤黏液中展现出更多样的模式识别受体（PRRs）和与适应性免疫相关的蛋白。在 Cichlidarus cichlidarum 感染后，参与催化活性、吞噬体形成、C型凝集素受体信号、PI3K-Akt信号、趋化因子信号以及补体和凝血级联反应的蛋白丰度显著增加。此外，研究人员在感染鱼的黏液中鉴定出多种寄生虫来源的蛋白，包括HSC70、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、钙调蛋白和硫氧还蛋白过氧化物酶，这些蛋白可能在寄生虫入侵和免疫逃逸中发挥关键作用。对这些蛋白的鉴定进一步为针对单殖吸虫的靶向干预开辟了新可能性，此类寄生虫仍然是对全球罗非鱼生产的重大威胁。