基于鼻分泌物多组学整合分析的慢性鼻窦炎伴鼻息肉无创内型分型候选标志物研究

《Journal of Inflammation Research》：Nasal Secretion Multi-Omics Reveals Candidate Signatures for Noninvasive Endotyping of Chronic Rhinosinusitis with Nasal Polyps

　　

背景：慢性鼻窦炎伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP）在生物学上具有异质性，然而能够区分嗜酸性粒细胞性CRSwNP（eosinophilic CRSwNP，eCRSwNP）与非嗜酸性粒细胞性CRSwNP（non-eosinophilic CRSwNP，neCRSwNP）的实用无创标志物仍然有限。本研究在一个小型初步队列中探索了与组织学定义的内型相关的鼻分泌物蛋白质组学和代谢组学特征。 方法：研究人员对来自对照组（n=5）、eCRSwNP（n=5）和neCRSwNP（n=5）的鼻分泌物进行了四维数据非依赖性采集（four-dimensional data-independent acquisition，4D-DIA）蛋白质组学和非靶向代谢组学分析。采用交集-排除策略，通过三次两两比较优先筛选与eCRSwNP相关的特征。进一步利用表观受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线性能、效应量、探索性多重检验支持度以及基于重复留一法交叉验证（leave-one-out cross-validation，LOOCV）的惩罚回归对候选蛋白进行排序。在另一个独立的同中心复制组（n=9）中，通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测了三种蛋白。在代谢组学质控后保留的9个匹配的eCRSwNP/neCRSwNP样本中，使用基于潜变量的数据整合生物标志物发现分析（Data Integration Analysis for Biomarker discovery using Latent cOmponents，DIABLO）进行多组学整合。 结果：在5874种蛋白中，4609种通过了过滤，全局主成分分析显示各组间分离有限。筛选策略优先确定了94种蛋白特征和28种推定注释的代谢特征。基于肿瘤蛋白D52（tumor protein D52，TPD52）、嗜酸性粒细胞过氧化物酶（eosinophil peroxidase，EPX）和跨膜蛋白263（transmembrane protein 263，TMEM263）的评分在eCRSwNP中高于neCRSwNP和对照组，且在ELISA验证组中呈现一致的变化趋势。DIABLO分析保留了这三种蛋白以及推定注释为鸟苷3',5'-环单磷酸和UDP-D-半乳糖的特征。在9个匹配样本中，整合模型的表观ROC曲线下面积（area under the ROC curve，AUC）为0.95，LOOCV误差为0.167；这些估计值仍易受选择偏倚和过拟合的影响。 结论：在这项小型、单中心研究中，鼻分泌物多组学分析识别出了与组织学定义的eCRSwNP相关的分子特征。这些发现是初步的，需要在更大的独立队列中通过靶向定量分析和配对组织水平的生物学验证来确认。

研究背景

慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）是一种常见的鼻窦黏膜炎症性疾病，其本质是生物学高度异质的，而非单一的临床病理实体。其中，嗜酸性粒细胞性CRSwNP（eCRSwNP）与非嗜酸性粒细胞性CRSwNP（neCRSwNP）在内源性炎症组成、组织重塑模式、术后复发倾向以及对药物治疗的反应等方面均存在显著差异，因此实现精准的内型分型对于指导个体化治疗至关重要。然而，目前临床上内型的判定主要依赖于术后组织的病理学评估，这种方法具有侵入性，不适用于术前风险分层或疾病进程的动态监测。尽管已有研究表明鼻分泌物作为一种局部、可重复获取的生物样本，可能比外周血更能反映黏膜局部的免疫和代谢状态，但目前针对CRSwNP亚型的、基于鼻分泌物的多组学研究仍然十分匮乏。因此，开发一种无创、便捷且信息丰富的内型分型方法具有重要的临床价值。

研究内容与结论

为解决上述问题，研究人员开展了一项探索性研究，旨在通过整合鼻分泌物的蛋白质组学和代谢组学数据，寻找能够无创区分eCRSwNP和neCRSwNP的候选分子标志物。研究招募了15名参与者作为发现队列，包括非CRS手术对照组（n=5）、组织学定义的eCRSwNP（n=5）和neCRSwNP（n=5）。此外，还纳入了另一组9名独立参与者用于初步的ELISA验证。通过系统的多步骤筛选和整合分析，研究人员鉴定出一个由三种蛋白组成的候选组合（TPD52、EPX和TMEM263），并在独立样本中通过ELISA验证了其变化趋势的一致性。进一步的跨组学整合分析构建了一个包含三种蛋白和两种代谢物的五特征组合模型，在9个匹配样本中显示出较高的表观区分效能。该研究的意义在于首次提出了基于鼻分泌物多组学的无创CRSwNP内型分型策略，为后续的大规模验证和临床应用转化提供了重要的候选靶点和理论依据。

主要关键技术方法

1. 1.
   样本收集与分组：研究人员在武汉大学人民医院招募参与者，将鼻息肉患者分为eCRSwNP和neCRSwNP两组（基于组织病理学中嗜酸性粒细胞占比≥10%的定义），并以非CRS手术患者作为对照。采用标准化的吸收性材料采集鼻分泌物，并在术前完成采样。
2. 2.
   蛋白质组学分析：对所有发现队列样本进行四维数据非依赖性采集（4D-DIA）蛋白质组学分析。使用Spectronaut软件进行蛋白鉴定和定量，并通过线性模型和经验贝叶斯调节（limma）进行差异丰度分析。
3. 3.
   代谢组学分析：对所有样本进行正负离子模式下的非靶向液相色谱-质谱联用（LC-MS）代谢组学分析。使用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）进行监督学习建模，并结合变量投影重要性（VIP）筛选差异代谢物。
4. 4.
   候选特征筛选与整合：采用交集-排除策略，即在eCRSwNP vs. 对照组和eCRSwNP vs. neCRSwNP中均有差异，但在neCRSwNP vs. 对照组中无差异的特征被优先考虑。随后，对候选蛋白进行ROC曲线分析、效应量筛选和基于留一法交叉验证（LOOCV）的稳定性选择，最终确定三个蛋白。最后，使用DIABLO（基于潜变量的数据整合分析）方法对蛋白和代谢物数据进行跨组学整合建模。

研究结果

蛋白质组学分析优先筛选出与eCRSwNP相关的候选蛋白和通路：蛋白质组学共鉴定5874种蛋白，其中4609种通过质控。全局主成分分析（PCA）显示三组间分离有限。通过交集-排除策略，研究人员优先筛选出94种与eCRSwNP相关的蛋白特征。对这些蛋白的通路富集分析（限于37种成功映射的蛋白）显示，它们主要富集于核苷酸糖生物合成、果糖和甘露糖代谢以及谷胱甘肽代谢等通路，提示碳水化合物加工、聚糖生物合成和氧化还原稳态可能与eCRSwNP的发病机制有关。

三蛋白候选组合显示出初步的队列内区分能力：通过进一步的ROC约束、差异丰度阈值和LOOCV稳定性选择三重筛选，三种蛋白——肿瘤蛋白D52（TPD52）、嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPX）和跨膜蛋白263（TMEM263）被确定为最稳健的候选标志物。基于这三种蛋白构建的综合评分在eCRSwNP组中显著高于neCRSwNP组和对照组，而neCRSwNP组与对照组之间无显著差异。在独立的同中心9人ELISA验证集中，这三种蛋白的变化方向与蛋白质组学数据一致，为该组合提供了初步的、正交平台的支持。

非靶向代谢组学优先筛选出推定注释的eCRSwNP相关代谢特征：非靶向代谢组学分析在排除一个代谢组学离群样本后，通过相同的交集-排除策略优先筛选出28种推定注释的与eCRSwNP相关的代谢特征。对这些特征的探索性KEGG通路分析提示它们可能涉及逆行内源性大麻素信号、叶酸转运与代谢、亚油酸代谢和甘油磷脂代谢等通路，为脂质介质重塑和炎症代谢提供了假设。

探索性多组学整合提示了数据集内的内型分离：在排除了代谢组学离群样本后的9个匹配CRSwNP样本（eCRSwNP=5，neCRSwNP=4）中，DIABLO整合分析最终保留了五个特征：TPD52、EPX、TMEM263，以及两个推定注释的代谢物——鸟苷3',5'-环单磷酸和UDP-D-半乳糖。在该小样本中，蛋白模块的表观AUC为0.75，代谢模块为0.85，整合模型为0.95，LOOCV误差为0.167。然而，由于特征筛选发生在重采样之前，这些表观性能指标很可能存在乐观偏差，不能被视为外部验证的诊断准确性。

讨论与结论

讨论总结：这项初步研究通过整合鼻分泌物蛋白质组学和代谢组学，成功识别出一系列与组织学定义的eCRSwNP相关的候选分子特征，包括一个三蛋白候选组合和一个五特征的DIABLO整合签名。研究的优势在于采用了鼻分泌物这一无创、可重复获取的局部生物样本，并设计了旨在减少广泛息肉相关信号的交集-排除筛选策略。EPX因其与嗜酸性粒细胞活化的直接关联，被认为是与内型联系最清晰的标志物。而TPD52和TMEM263虽非已知的CRSwNP标志物，但其在分泌性上皮中的潜在功能以及HPA数据库中的表达数据为其生物学合理性提供了线索。代谢组学结果则产生了关于脂质介质重塑和炎症代谢的新假设。然而，研究存在诸多局限性，包括极小的样本量（每组仅5例）、单中心设计、缺乏配对的组织对比验证、代谢物身份未经标准品确认，以及所有性能指标均易受选择偏倚和过拟合影响。因此，这些发现仅为初步候选，远未达到临床验证水平。

结论翻译：在这项小型、单中心的初步研究中，鼻分泌物蛋白质组学和代谢组学识别出了与组织学定义的eCRSwNP相关的候选特征。一项交集-排除策略产生了一个三蛋白候选组合，其在独立参与者的同中心ELISA测量中得到了方向性趋势的再现。多组学整合进一步在9个匹配样本中生成了一个五特征签名，但其表观性能易受选择偏倚和过拟合的影响。在将这些信号视为具有临床信息价值之前，需要在更大的独立队列中进行靶向定量分析和配对组织分析。