EGCG预处理的骨髓间充质干细胞来源细胞外囊泡通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路及PINK1相关线粒体质量控制减轻内皮细胞衰老

《Life》：Epigallocatechin Gallate-Primed Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell-Derived Extracellular Vesicles Attenuate Endothelial Senescence by Modulating PI3K/AKT/mTOR Signaling and PINK1-Associated Mitochondrial Quality Control

　　

摘要 （1）背景：氧化应激诱导的内皮细胞衰老与线粒体功能障碍、线粒体质量控制受损及促炎信号转导相关。研究人员探讨了来源于表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）预处理的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的细胞外囊泡（EVs）是否能够保护衰老的人主动脉内皮细胞（HAECs）。（2）方法：采用H2O2诱导HAECs衰老。分离并表征了来自未经处理和EGCG预处理的BMSCs的EVs。利用CCK-8和EdU实验、衰老相关β-半乳糖苷酶染色、Transwell迁移实验、JC-1染色、透射电子显微镜、线粒体-溶酶体共定位、蛋白质印迹法、Mdivi-1、PINK1敲低以及PI3K激活剂740 Y-P，评估了细胞增殖、衰老、凋亡相关蛋白、线粒体形态和膜电位、线粒体自噬相关标志物、衰老HAECs诱导的RAW264.7巨噬细胞迁移以及PI3K/AKT/mTOR信号通路。（3）结果：EGCG预处理的BMSC来源EVs被HAECs摄取，并减轻了H2O2诱导的衰老，增加了细胞增殖，并将β-Gal阳性细胞从36.47%降低至10.17%，RAW264.7巨噬细胞迁移从720.33降低至123.67。这些EVs恢复了线粒体膜电位，增强了PINK1/Parkin相关的线粒体质量控制，并抑制了PI3K/AKT/mTOR磷酸化。相对于相应的H2O2加干预对照组，Mdivi-1、PINK1敲低和740 Y-P减弱了这些保护作用。（4）结论：EGCG预处理增强了BMSC来源EVs对抗H2O2诱导的内皮细胞衰老的保护活性，其中涉及PI3K/AKT/mTOR抑制和PINK1相关的线粒体质量控制。

论文解读

血管内皮细胞衰老被认为是内皮功能障碍和动脉粥样硬化（AS）发生发展的重要促进因素。动脉粥样硬化是心肌梗死、脑卒中和外周动脉疾病等重大心血管疾病的病理基础。在氧化、炎症和代谢应激条件下，人主动脉内皮细胞（HAECs）可发生早衰，伴随增殖、迁移和血管生成能力受损，以及衰老相关分泌表型（SASP）因子包括IL-6、TNF-α和iNOS释放增加。这些变化损害内皮屏障功能，促进炎性细胞浸润和脂质沉积，从而促进斑块形成和不稳定。线粒体稳态对内皮细胞正常功能至关重要，线粒体损伤和活性氧（ROS）过度积累是衰老内皮细胞的显著特征。线粒体自噬作为选择性清除受损或功能障碍线粒体的过程，对线粒体质量控制、能量代谢和细胞应激抵抗具有重要作用。线粒体自噬受损会导致功能障碍线粒体积累并持续氧化和炎症应激，进一步加重内皮细胞衰老和动脉粥样硬化进展。骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源的细胞外囊泡（EVs）具有低免疫原性、良好生物相容性和货物递送能力，可通过转移蛋白质、microRNAs和生物活性脂质影响受体细胞的增殖、凋亡、自噬和血管生成。然而，未经预处理的MSCs-EVs在氧化和炎症条件下的活性可能有限，因此药物预处理策略受到关注。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）作为绿茶的主要生物活性成分，具有抗氧化、抗炎和抗衰老特性，并可调节自噬和线粒体功能。但EGCG预处理的BMSC来源EVs是否通过线粒体质量控制保护内皮细胞免受氧化应激诱导的衰老仍不清楚。PINK1/Parkin通路是线粒体自噬和炎症的经典调控因子，而PI3K/AKT/mTOR信号通路是细胞生长、自噬和炎症的主要调控因子。本研究旨在探讨EGCG预处理的BMSC来源EVs对H₂O₂诱导的HAECs衰老的保护作用及其分子机制。

研究人员从4周龄雄性Sprague-Dawley大鼠股骨和胫骨中分离BMSCs，并诱导HAECs衰老。通过超速离心法从BMSCs条件培养基中分离EVs，其中MSCs^EGCG-EVs来自经5 μmol/L EGCG预处理24小时的BMSCs。研究采用透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒追踪分析（NTA）表征EVs形态和粒径分布；采用蛋白质印迹法检测EVs标志物及细胞衰老、凋亡、线粒体自噬和信号通路相关蛋白表达；采用CCK-8和EdU实验评估细胞增殖；采用衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色评估细胞衰老；采用Transwell实验评估RAW264.7巨噬细胞迁移；采用JC-1染色检测线粒体膜电位；采用MitoTracker和LysoTracker共定位分析评估线粒体-溶酶体共定位；采用Mdivi-1（线粒体分裂调节剂和Drp1抑制剂）、PINK1小干扰RNA（siRNA）敲低和PI3K激活剂740 Y-P进行机制验证。

研究结果如下。3.1 EGCG预处理的BMSCs和BMSC来源EVs的表征：BMSCs具有成脂、成骨和成软骨分化能力。TEM显示MSCs-EVs和MSCs^EGCG-EVs均呈杯状或球形形态。两种EVs均表达TSG101、CD9和CD81，不表达内质网标志物Calnexin。NTA显示大多数分离颗粒直径约为100–250 nm。3.2 MSCs^EGCG-EVs促进衰老HAECs增殖：DiI标记的EVs可被HAECs内化。CCK-8实验显示10和20 μg/mL MSCs^EGCG-EVs显著提高衰老HAECs活力。EdU实验证实MSCs^EGCG-EVs处理后EdU阳性细胞比例增加。3.3 MSCs^EGCG-EVs减轻HAECs衰老并减少巨噬细胞迁移：MSCs^EGCG-EVs最大程度降低了SA-β-Gal阳性细胞比例，并显著抑制H₂O₂诱导的iNOS、IL-6、TNF-α、P16和P21表达升高。Transwell实验显示MSCs^EGCG-EVs最大程度减少了RAW264.7巨噬细胞向衰老HAECs的迁移。3.4 MSCs^EGCG-EVs改善线粒体形态并增强线粒体质量控制相关变化：MitoTracker成像显示MSCs^EGCG-EVs最大程度改善了H₂O₂诱导的线粒体碎片化。TEM显示MSCs^EGCG-EVs处理后出现更多与线粒体相关的自噬结构。蛋白质印迹显示MSCs^EGCG-EVs进一步增加PINK1和Parkin表达，降低P62，增加LC3B-II/I比值。3.5 MSCs^EGCG-EVs恢复线粒体膜电位并增加线粒体-溶酶体共定位：JC-1染色显示MSCs^EGCG-EVs最大程度恢复了红绿荧光比值。MitoTracker和LysoTracker共定位分析显示MSCs^EGCG-EVs增加了线粒体-溶酶体重叠信号。3.6 Mdivi-1减弱MSCs^EGCG-EVs的保护作用：Mdivi-1单独不诱导衰老但加重H₂O₂诱导的衰老。Mdivi-1减弱了MSCs^EGCG-EVs降低SA-β-Gal阳性、抑制衰老和凋亡相关蛋白表达以及减少巨噬细胞迁移的作用。3.7 PINK1敲低对MSCs^EGCG-EVs作用的影响：PINK1敲低加重H₂O₂诱导的衰老，并减弱MSCs^EGCG-EVs降低SA-β-Gal阳性、抑制衰老和凋亡相关蛋白表达、减少巨噬细胞迁移以及增加线粒体-溶酶体共定位的作用。3.8 PI3K激活减弱MSCs^EGCG-EVs对线粒体质量控制相关蛋白、衰老和巨噬细胞迁移的作用：H₂O₂增加PI3K、AKT和mTOR磷酸化，MSCs^EGCG-EVs降低这些磷酸化水平，而740 Y-P减弱了这些降低作用。740 Y-P还减弱了MSCs^EGCG-EVs对PINK1、Parkin和LC3B-II/I比值的增加作用，增加P62水平，并减弱对NF-κB p65磷酸化的抑制作用以及对SA-β-Gal阳性和巨噬细胞迁移的降低作用。

讨论部分指出，MSCs^EGCG-EVs通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路，减少AKT介导的NF-κB磷酸化和激活，从而抑制iNOS、IL-6和TNF-α等炎症基因的转录启动，同时PINK1/Parkin相关的线粒体质量控制清除受损线粒体。研究存在局限性：所有功能实验均使用H₂O₂诱导的体外模型，未评估动脉粥样硬化病变或体内治疗效果；使用大鼠BMSC来源EVs作用于人HAECs和小鼠RAW264.7巨噬细胞，存在跨物种系统；MSCs^EGCG-EVs活性增强的miRNAs、蛋白质或脂质尚不清楚；未使用溶酶体阻断或专用报告基因定量线粒体自噬通量；长期安全性、生物分布和药代动力学需在临床转化前评估。结论部分指出，EGCG预处理的BMSC来源EVs减轻了H₂O₂诱导的内皮细胞衰老，表现为增殖增加、β-Gal阳性细胞从36.47%降至10.17%、RAW264.7巨噬细胞迁移从720.33降至123.67。这些EVs恢复了线粒体膜电位，增强了PINK1/Parkin相关线粒体质量控制标志物，并抑制了PI3K/AKT/mTOR磷酸化。相对于相应的H₂O₂加干预对照组，在Mdivi-1、PINK1敲低和740 Y-P存在下，MSCs^EGCG-EVs保留了部分保护作用，但保护程度小于无干预时。这些发现提示线粒体动力学、PINK1相关线粒体质量控制和PI3K/AKT/mTOR信号通路参与了EV介导的保护作用，支持抑制PI3K/AKT/mTOR可能解除PINK1/Parkin相关线粒体质量控制的抑制从而减轻内皮细胞衰老和SASP驱动的巨噬细胞募集的模型。由于证据来自跨物种体外模型且未测试动脉粥样硬化病变模型，需要进一步的体内和人类细胞研究才能得出治疗结论。EGCG预处理的BMSC来源EVs代表了一种靶向内皮细胞衰老的潜在无细胞策略，但其在动脉粥样硬化中的疗效和安全性仍有待确定。