《Cell Stem Cell》：Organotypic vascularization improves maturation of human stem cell-derived islets and restores normoglycemia in diabetic mice
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人类多能干细胞来源的胰腺胰岛类器官（pancreatic islet organoids, PIOs）为治疗1型糖尿病（type 1 diabetes, T1D）带来了希望，但移植后因血管化不足导致的存活率低下仍是主要挑战。在本研究中，研究人员通过将PIOs与
人类多能干细胞来源的胰腺胰岛类器官（pancreatic islet organoids, PIOs）为治疗1型糖尿病（type 1 diabetes, T1D）带来了希望，但移植后因血管化不足导致的存活率低下仍是主要挑战。在本研究中，研究人员通过将PIOs与血管类器官（blood vessel organoids, BVOs）共培养，生成了血管化的PIOs（vascularized PIOs, VPIOs），形成了具有BVO来源毛细血管网络的整合结构，这些毛细血管网络深入胰岛结构内部。这些血管在结构上表现出胰岛特异性内皮的窗孔特征，并携带器官型血管的分子特征。VPIOs内的β细胞表现出部分增强的成熟度，以及对缺氧和内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激更强的抵抗力。将VPIOs皮下移植到糖尿病小鼠体内后，其存活率显著提高，能与宿主循环建立血管连接，并恢复长期血糖正常。该研究提出了一种生成血管化胰岛类器官的策略，该策略在体外增强了β细胞成熟和组织特异性血管特化，并在体内关键地改善了移植物的存活和功能。
**论文解读：人干细胞来源胰岛类器官的器官型血管化促进β细胞成熟并恢复糖尿病小鼠血糖正常**
**一、研究背景与科学问题**
1型糖尿病（type 1 diabetes, T1D）影响全球超过800万人口，每年新增约50万病例。尽管外源性胰岛素广泛应用于临床，但患者仍需承受频繁注射的负担及长期并发症的风险。胰岛移植能够稳定血糖并减轻高血糖，然而供体胰腺来源极为有限。人多能干细胞（human pluripotent stem cells, hPSCs）来源的胰腺胰岛类器官（pancreatic islet organoids, PIOs）为替代治疗提供了广阔前景。然而，移植后48小时内大量β细胞死亡是制约其疗效的关键瓶颈，主要原因在于移植物血管化不足导致的缺氧微环境。天然胰岛毛细血管不仅供给氧气和营养，还通过分泌肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）及血小板反应蛋白-1（thrombospondin-1, THBS1）等营养因子支持胰岛细胞功能与存活。此外，胰岛内皮的窗孔结构是实现快速葡萄糖感应和激素转运的关键结构特征。然而，现有的离体模型无法完全重现这类特化毛细血管。以往研究中使用的脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）属于大血管内皮细胞，体外倾向形成大血管，无法完整重现器官特异性内皮特性，且通常需要基质细胞支持，增加了体系变异性和复杂性。因此，研究人员旨在通过工程化手段构建血管化的胰岛类器官，以更好地模拟天然胰岛并改善移植结局。
**二、主要技术方法**
为构建血管化胰岛类器官，研究人员利用人胚胎干细胞系H1（含INS-GFP报告基因）分化来源的SC-islet细胞，与预先在AggreWell微孔板中由人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）系WTC11分化形成的、大小可控的血管类器官（blood vessel organoids, BVOs）共培养，使二者整合形成血管化胰岛类器官（vascularized PIOs, VPIOs）。并通过将VPIOs包埋于Matrigel/collagen I基质中以促进血管网络出芽生长。研究应用免疫荧光染色、透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）、单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）、Seahorse线粒体功能分析、钙成像、静态及动态葡萄糖刺激胰岛素分泌（glucose-stimulated insulin secretion, GSIS）实验等方法，对VPIOs的血管结构、β细胞成熟度及功能进行了系统表征。体内实验中，研究人员将VPIOs皮下移植于链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）诱导的糖尿病NOD scid gamma（NSG）免疫缺陷小鼠模型，并以原代人胰岛（primary human islets, PHIs）作为阳性对照，通过监测空腹血糖水平、腹腔葡萄糖耐量试验（intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT）及人C肽水平评估其治疗效果。
**三、主要研究结果**
**1. 从干细胞生成血管化人胰岛类器官**
研究人员将解离的SC-islet细胞与预先形成的BVOs在AggreWell中共培养，2-3天后二者整合形成三维复合结构，即VPIOs。免疫染色显示VPIOs内部存在致密的CD31+血管网络，经Matrigel/collagen I基质包埋培养后血管网络进一步延伸，密度与PHIs相当。电镜观察发现VPIOs内部存在管腔化结构，且邻近β细胞。流式分析显示BVO中约20%为内皮细胞（endothelial cells, ECs）、20%为壁细胞/周细胞，INS+ β细胞与ECs比例约为1:1。这些结果表明成功建立了血管化胰岛类器官体系。
**2. 器官型胰岛毛细血管的形成**
TEM证实VPIOs中ECs呈现不连续的、点状的CD31染色模式，与PHIs中ECs相似，且窗孔相关标志物PLVAP表达显著高于BVOs。TEM作为金标准证实VPIOs中ECs存在窗孔结构，与胰岛细胞紧密相邻，而BVOs中罕见。scRNA-seq分析显示，VPIOs中ECs的“原代胰岛样”特征评分显著高于BVOs，且移植后（VPIO-TP）更接近天然原代胰岛特征。转录组分析显示VPIOs中ECs上调窗孔相关基因（PLVAP, PLPP3, PLPP1）、血管通透性相关基因（ESM1, PROS1, ANGPTL4），并下调与窗孔负相关的CLDN5。差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）比较分析显示，VPIOs中ECs在转录水平上更接近胰腺内分泌相关ECs而非其他器官ECs。CellChat分析预测β细胞通过VEGFA-VEGFR1/2等信号与ECs通讯。功能实验证实，VEGFR2抑制可减少VPIOs中ECs的窗孔形成，而高剂量VEGFA处理BVOs则可诱导窗孔形成，表明β细胞来源的VEGFA在驱动胰岛特异性内皮特化中发挥积极作用。
**3. 血管化改善胰岛类器官中β细胞的成熟和功能**
TEM显示VPIOs中β细胞总胰岛素颗粒数较PIOs减少，但成熟颗粒（具有致密晶体核心和明显晕圈）比例显著升高，虽然仍低于原代β细胞。线粒体分析显示VPIOs中β细胞线粒体更大，嵴面积比更高。Seahorse线粒体压力测试表明VPIOs较PIOs+BVOs混合物具有更高的ATP产生、最大呼吸和备用呼吸能力。免疫染色显示VPIOs中MAFA+和UCN3+ β细胞比例升高，qPCR证实UCN3和MAFA上调，同时“非允许基因”HK1、SLC16A1、LDHA下调。钙成像和静态GSIS均显示VPIOs中β细胞对高葡萄糖的响应功能增强，动态GSIS也验证了VPIOs在高糖刺激下更强的胰岛素分泌。但VPIOsβ细胞的成熟度和功能水平仍低于PHIs。
**4. 血管化胰岛类器官的单细胞图谱**
scRNA-seq分析显示VPIOs包含ECs、周细胞、成纤维样细胞、胰腺内分泌和外分泌细胞等群体。将内分泌细胞投射到胎儿胰腺图谱后，VPIOsβ细胞与胎儿图谱β细胞的转录组相关性高于PIOsβ细胞及已发表的其他干细胞来源胰岛数据集。GO分析显示VPIOsβ细胞富集肽分泌、cAMP信号、缺氧反应、Wnt和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）信号等通路。CellChat分析预测ECs通过细胞外基质（extracellular matrix, ECM）-受体相互作用（如LAMB1-ITGA1等）与β细胞通讯，提示血管系统构建了支持β细胞的ECM富集微环境。
**5. 血管化保护β细胞免受缺氧和内质网应激**
体外模拟缺氧（1% O?）条件下，PIOs中约50%的β细胞在18小时死亡，40小时接近70%；而VPIOs中β细胞死亡显著减少。PIOsβ细胞在缺氧下表现出更高的促凋亡标志物DDIT3（CHOP）表达和更低的XBP1剪接比，提示其适应性内质网应激反应较弱。在给予内质网应激诱导剂毒胡萝卜素（thapsigargin）处理后，VPIOs中β细胞死亡同样显著低于PIOs。机制研究表明，BMP4主要由ECs和成纤维样细胞表达，激活VPIOs中多种内分泌细胞（包括β细胞）的BMP/BMPR通路。用NOGGIN抑制BMP信号可消除VPIOsβ细胞在缺氧下的存活优势，而外源BMP4则可显著减少PIOsβ细胞在缺氧下的死亡。
**6. 血管化β细胞在体内移植中存活率提高**
将PIOs和VPIOs皮下移植到免疫缺陷小鼠后，移植后2天和5天，VPIOs移植物中死亡β细胞（PI+DAPI+）比例均显著低于PIOs移植物，免疫染色也证实VPIOs中cleaved caspase-3（CC3）+凋亡β细胞更少。
**7. 移植血管化胰岛类器官逆转糖尿病高血糖**
在STZ诱导的糖尿病NSG小鼠模型中，VPIOs移植组（13只中11只）在2个月观察期内实现血糖正常化，恢复比例和速度显著优于PIOs组（14只中仅2只）以及PIOs+BVOs混合物组。VPIOs移植组在4周和8周IPGTT中表现出显著改善的葡萄糖耐量，人C肽水平高于PIOs和PIOs+BVOs组，且与PHIs移植组相当。
**8. 人血管与宿主血管系统的结构和功能整合**
移植后2周和8周，VPIOs移植物中可见大量人CD31+血管网络，且人源血管数量多于宿主鼠源血管。8周时观察到人血管与鼠血管的直接物理连接。尾静脉注射荧光葡聚糖后，VPIOs移植物中约40%的人源血管可检测到灌注信号，证明移植物来源的人血管系统与宿主循环建立了功能性吻合。移植后ECs仍保持窗孔特征。
**9. 移植后干细胞来源血管化胰岛的单细胞转录组分析**
移植后3个月scRNA-seq分析显示，与体外相比，移植后两组中肠嗜铬样β细胞和内分泌祖细胞均显著减少。VPIO-TP和PIO-TP的β细胞与成人和儿童胰岛β细胞的转录组相似度高于胎儿β细胞，且成熟、功能及胰岛素分泌相关基因显著上调。GO分析显示钙信号、激素信号、缺氧反应、PI3K-Akt、MAPK、Wnt和BMP4等与β细胞存活和功能相关的通路富集。VPIO-TP组β细胞中存活相关基因（BCL2, SOCS1, NR4A1, REG1A, NFE2L2）显著上调。
**四、讨论与结论**
该研究成功构建了血管化胰岛类器官VPIOs，其核心创新在于利用完整的血管类器官而非单一内皮细胞，实现了胰岛类器官内部致密且具有器官型特征的毛细血管网络形成。VPIOs中的内皮细胞获得了胰腺胰岛特异性分子特征和窗孔结构，且这一特化过程部分由β细胞来源的VEGFA驱动。血管化在体外部分促进了β细胞成熟并增强了其对缺氧和内质网应激的抵抗力，机制上BMP4是关键旁分泌介质之一。体内移植后，VPIOs表现出早期β细胞存活率的显著提高，并与宿主循环建立了功能性血管连接，最终有效逆转了糖尿病小鼠的高血糖。该研究为干细胞来源胰岛移植提供了一种有前景的血管化策略。
研究结论为：通过将胰岛类器官与血管类器官共培养，可在体外生成具有器官型血管网络的血管化胰岛类器官；该血管化策略能部分促进β细胞成熟、增强β细胞应激抵抗力和体内移植存活率，并在糖尿病小鼠模型中恢复长期血糖正常，其疗效接近原代人胰岛。
